脂肪干細胞對D-半乳糖致裸鼠皮膚老化的拮抗作用及對皮膚恢復功能的影響

魏姝玥 王海英 李愛蘭 鄭優(yōu)優(yōu) 李健華 袁春英 游云天 馬強

[摘要]目的：本文通過研究脂肪干細胞（Adipose stem cells，ASCs）在D-半乳糖誘導裸鼠皮膚老化的拮抗作用及其對皮膚恢復功能的影響，旨在探討抗衰老機制并為臨床上抗衰老療法提供新的思路。方法：選擇SPF級裸鼠40只，隨機分為4組：對照組、D-半乳糖+磷酸鹽緩沖液（PBS）組、D-半乳糖+ASCs組與D-半乳糖+氨基胍（AG）組，每組10只。對D-半乳糖+PBS組，D-半乳糖+ASCs組和D-半乳糖+AG組的裸鼠的背部進行皮下注射1 000mg/kg D-半乳糖，每天1次，持續(xù)8周。2周之后，3組小鼠背部分別注射PBS緩沖液（0.5ml）、ASCs（1×106/ml）和AG（100mg/kg），均注射至真皮層，每天1次，4周后處死。取每組皮膚組織，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA），黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD），ELISA法測定晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、總膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平。通過HE染色和馬松染色比較各組皮膚組織真皮層厚度及膠原分布比，采用免疫組化測定各組CD31及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達情況。結(jié)果：四組裸鼠的體重與模型構(gòu)建前并無顯著差別。對照組裸鼠表現(xiàn)為充滿活力，反應敏捷，并且皮膚富有彈性，糞便無明顯臭味;衰老小鼠模型皮膚逐漸變?nèi)?，變薄，失去彈性，并患有便秘，且排泄物發(fā)臭;而經(jīng)ASCs或AG處理的小鼠裸鼠在處理后情況有所改善。相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠SOD、總膠原蛋白、CD31、VEGF、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平顯著降低，MDA及AGEs表達量顯著增加，而通過ASCs或AG處理的裸鼠各指標水平均有所改善。HE及馬松染色結(jié)果顯示，相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠真皮層相對較薄，膠原分布比明顯降低，而經(jīng)ASCs或AG處理的裸鼠鼠真皮層有所增厚，膠原分布比顯著上升。結(jié)論：ASCs移植對D-半乳糖誘發(fā)衰老的裸鼠的自由基與糖基化水平具有良好的拮抗作用，為ASCs的移植抵抗肌膚衰老的理論提供了實驗依據(jù)。

[關鍵詞]脂肪干細胞;D-半乳糖;皮膚老化;裸鼠;拮抗作用

[中圖分類號]R622 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）01-0062-06

Antagonistic Effect of Adipose-derived Stem Cells on Skin Aging Induced by D-galactose in Nude Mice and its Effect on Skin Recovery

WEI Shu-yue，WANG Hai-ying，LI Ai-lan，ZHENG You-you，LI Jian-hua，YUAN Chun-ying，YOU Yun-tian，MA Qiang

（Department of Dermatology & STD，Dongying People's Hospital，Dongying 257091，Shandong，China）

Abstract： Objective ?To investigate the anti-aging mechanism and provide new ideas for clinical anti-aging therapy by studying the antagonism of adipose-derived stem cells （ASCs） in D-galactose-induced skin aging in nude mice and its effect on skin recovery. Methods Forty-one SPF nude mice were randomly divided into 4 groups： control group， D-galactose +phosphate buffer（PBS） group， D-galactose+ASCs group and D-galactose+aminopurine（AG） Group， 10 in each group. The back of D-galactose+PBS group， D-galactose+ASCs group and D-galactose +AG group were injected subcutaneously with 1 000mg/kg D-galactose once a day for 8 weeks. After 2 weeks， the mice in the three groups were injected with PBS buffer （0.5ml）， ASCs （1×106/ml）， and AG （100mg/kg）， respectively， and injected into the dermis layer once a day， and sacrificed 4 weeks later. For each group of skin tissues， malondialdehyde （MDA） was determined by thiobarbituric acid method， superoxide dismutase （SOD），Collagen， type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen were determined by xanthine oxidase method， and advanced glycation end products（AGEs） were determined by ELISA. The dermis thickness and collagen distribution ratio of skin tissue were compared by HE staining and Masson staining. The expression of CD31 and vascular endothelial growth factor（VEGF） in each group were determined by immunohistochemistry. Results ?The body weight of the four groups of nude mice was not significantly different from that before the model was constructed. The nude mice in the control group showed vigorousness， rapid response， and the skin was elastic， and the feces had no obvious odor. The skin of the aging mouse model gradually weakened， thinned， lost elasticity， suffered constipation， and the excrement smelled. Mouse nude mice treated with ASCS or AG improved after treatment. Compared with the control group， the SOD、CD31、VEGF、Collagen， type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen levels of D-galactose+PBS group was significantly decreased， and the expression levels of MDA and AGEs were significantly increased， while the levels of all the indexes of nude mice treated by ASCS or AG were improved. The results of HE and Masson staining showed that the dermis layer of D-galactose+PBS group was relatively thin compared with the control group， and the collagen distribution ratio was significantly decreased， while the dermis layer of nude mice treated with ASCS or AG increased. Thick， collagen distribution ratio increased significantly. Conclusion ?The transplantation of ASCs has a good antagonistic effect on the free radical and glycosylation level of D-galactose-induced aging nude mice， and provides an experimental basis for the theory of ASC transplantation against skin aging.

Key words： adipose stem cells; D-galactose; skin aging; nude mice; antagonism

皮膚老化是在多種因素作用下所致的皮膚衰老現(xiàn)象，由于皮膚中重要成分如水分、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、膠原蛋白等的減少，導致皮膚表現(xiàn)為彈性和柔軟性的降低，皺紋出現(xiàn)，皮膚干燥、角化過度以及色素沉著[1-2]。隨著社會的發(fā)展，關于皮膚的抗老化治療已成為醫(yī)學美容的關注熱點。由D-半乳糖誘導的嚙齒類動物的亞急性衰老模型具有價格低廉、造模簡便易行、結(jié)果穩(wěn)定等特點，已廣泛運用于抗衰老的藥理研究中[3-4]。糖基化是一種在膠原蛋白中游離氨基酸組之間的非酶反應，同時也是由氧活化基因誘導的氧化反應[5]。研究表明，由還原糖和蛋白質(zhì)之間的反應而誘導的糖基化是引起機體衰老的重要因素[6]。自由基具有超強的氧化能力，其可氧化生物膜的不飽和脂質(zhì)并產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物（LPO）[7]。丙二醛（MDA）為自由基的最終產(chǎn)物，研究表明，MDA可影響細胞間的物質(zhì)交換，最終導致細胞的破裂和死亡[8-9]。機體各類物質(zhì)的代謝過程均可導致自由基的過氧化反應，從而引起自由基的不平衡。而一旦自由基引起的損害超出了機體的自我恢復能力，將導致細胞分化狀態(tài)有所改變，影響細胞的分化能力，最終導致皮膚的衰老。

脂肪干細胞（Adipose stem cells，ASCs）可分化為血管內(nèi)皮細胞和脂肪細胞，并能夠促進血管和脂肪組織的形成。ASCs廣泛存在于人體內(nèi)，在一定程度上，其可應用于軟組織的填充[10]。已有研究表明，ASCs合成的可注射型支架材料可用于皮膚的抗衰老的軟組織填充中[11]?；诖耍狙芯恳訡57BL/6-GFP小鼠的雙側(cè)腹股溝分離出來的脂肪作為組織來源，在經(jīng)過分離，培養(yǎng)以及傳代后，將脂肪干細胞移植到裸鼠背部的真皮層中。探討移植后的脂肪干細胞對自由基以及誘發(fā)裸鼠亞急性衰老的D-半乳糖的糖基化的影響效應，旨在探討抗衰老機制并為臨床上抗衰老療法提供新思路。

1 ?材料和方法

1.1 實驗動物：選用SPF級裸鼠40只，雄性，體質(zhì)量17～23g[山東省動物實驗中心，合格證：SCXK（魯）2018-0037]。于屏障環(huán)境下飼養(yǎng)1周后開始實驗，將40只裸鼠隨機分為4組[對照組、D-半乳糖+磷酸鹽緩沖液（PBS）組、D-半乳糖+ASCs組與D-半乳糖+氨基胍（AG）組]，每組10只，進行分籠飼養(yǎng)。同時選用SPF級C57BL/6-GFP小鼠10只，用于脂肪干細胞的提取。所有實驗用動物飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度為22℃～25℃，濕度為55%～65%，模擬晝夜交替，每日光照12h。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 主要試劑：高糖DMEM（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），青霉素、鏈霉素（Gibco公司），PBS緩沖液（北京鼎國生物科技有限公司），D-半乳糖（Sigma公司），氨基胍（Sigma公司），丙二醛（MDA）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）ELISA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），總膠原蛋白ELISA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），Ⅰ型膠原蛋白ELISA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），Ⅲ型膠原蛋白ELISA試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）免疫組化試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），CD31免疫組化試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），HE染色試劑（國藥集團化學試劑有限公司），馬松染色試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2.2 主要儀器：倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），光學顯微鏡（日本奧利巴斯公司），內(nèi)切式組織勻漿機 （上海朗晟生物科技有限公司），圖像數(shù)字化處理分析系統(tǒng)（德國LEICA公司），切片機（英國珊頓公司），Bio Rad 450酶標儀（美國Bio Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 脂肪干細胞的分離：取C57BL/6-GFP小鼠的腹股溝處完整的脂肪墊，放置在培養(yǎng)皿中。采用PBS溶液對取下的脂肪墊進行反復沖洗3次以洗掉其表面殘留的血液，去除脂肪墊上可見的纖維結(jié)締組織。隨后將脂肪墊切成1mm3的小的組織塊，并添加同等比例的0.25% Ⅰ型膠原酶，然后將組織塊放置到37℃電熱恒溫水槽中分解45min。在分解過程中，搖晃2～3次并使兩種溶液充分混合。分解后，添加培養(yǎng)基[高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）+1%的青霉素混合溶液（10 000IU）]以及同等體積的鏈霉素（10 000pg/ml）進行中和，并使用2-篩孔進行過濾。將得到的溶液以1 200rpm/min離心5min，使用一次性吸管吸出上清液，將沉淀物加入到1ml培養(yǎng)基中制成懸浮液，隨后加入六倍體積的紅細胞裂解平衡液，混勻，于常溫下孵育8min。孵育結(jié)束后，將該溶液再次以1 200rpm/min離心5min，并去除上清液。將沉淀物加入到1ml培養(yǎng)基中制成懸浮液，并將得到的懸浮液接種在培養(yǎng)皿中，于細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)。

1.3.2 半乳糖誘導裸鼠衰老模型的構(gòu)建：對D-半乳糖+PBS組，D-半乳糖+ASCs治療組和D-半乳糖+AG組的裸鼠的背部進行皮下注射1 000mg/kg D-半乳糖，每天1次，持續(xù)8周。所有的注射操作均采用無菌技術，并用紫藥水對每一個注射點進行標記。

1.3.3 分組干預：ASCs在分離、培養(yǎng)和傳代后，將第三代ASCs通過0.05%消化酶進行分解;對得到的細胞懸浮液以1 000rpm/min離心5min。離心結(jié)束后，去掉上清液，并加入0.5ml的PBS溶液重新對細胞進行懸浮。并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。

模型構(gòu)建兩周之后，對D-半乳糖+PBS組，D-半乳糖+ASCs治療組和D-半乳糖+AG組裸鼠背部分別注射PBS緩沖液（0.5ml）、ASCs（1×106/ml）和AG（100mg/kg），均注射至真皮層，每天1次，4周后處死。

1.3.4 檢測指標：從每組裸鼠的注射區(qū)域取下0.5g的皮膚組織塊。然后采用預冷的生理鹽水沖洗組織塊，并去除皮下脂肪和結(jié)締組織，用濾紙擦干皮膚組織塊。采用組織勻漿機（于冰水環(huán)境下）將皮膚組織制成10%的組織勻漿，反復溶解三次，直到細胞被完全破壞，所有成分均在液相狀態(tài)進行分離。取各組的上清液進行與老化相關的生物標志物以及晚期糖基化終末產(chǎn)物的檢測。具體操作步驟按照相應的說明書進行。采用硫代巴比妥酸法測定MDA，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD），ELISA法測定晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、總膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平。

取每組裸鼠的注射區(qū)域的皮膚組織塊，將其制成切片。所有皮膚組織塊切片均用HE染色、馬松染色進行處理。比較各組皮膚組織真皮層厚度及膠原分布比，采用免疫組化測定各組CD31及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達情況，VEGF工作溶液的稀釋率為1：500，CD31工作溶液的稀釋率為1：100。

1.4 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用例數(shù)和百分數(shù)表示，計量數(shù)據(jù)用平均值±標準差（x?±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊性，采用LSD檢驗，若方差不齊，采用Dunnett-t3檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 ?結(jié)果

2.1 四組裸鼠一般狀況及體質(zhì)量變化情況：四組裸鼠的體重與模型構(gòu)建前并無顯著差別。對照組裸鼠表現(xiàn)為充滿活力，反應敏捷，并且皮膚富有彈性，糞便無明顯臭味;衰老小鼠模型皮膚逐漸變?nèi)?，變薄，失去彈性，并患有便秘，且排泄物發(fā)臭;而經(jīng)ASCs或AG處理的小鼠裸鼠在處理后情況有所改善。見圖1。

2.2 四組SOD及MDA水平比較：相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠SOD水平顯著降低，MDA水平顯著增加，而通過ASCS或AG處理的裸鼠各指標水平均有所改善。見圖2。

2.3 四組AGEs水平比較：相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠AGEs水平顯著增加，而通過ASCs或AG處理的裸鼠AGEs水平有所改善。見圖3。

2.4 四組真皮層厚度以及膠原比值情況比較：HE染色組織學觀察結(jié)果顯示，在注射D-半乳糖后，小鼠皮膚及其附屬器官發(fā)生顯著變化。HE染色后，小鼠皮膚的真皮層變成紅色，細胞核呈深藍色，在膠原纖維中可見大量的深藍色的梭形成纖維細胞核。在光學顯微鏡下對每個皮膚樣品的真皮厚度進行統(tǒng)計分析。注射4周后，四組皮膚樣品的真皮層的厚度均發(fā)生顯著變化。組織學檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在D-半乳糖模型組的小鼠的真皮層厚度相對較薄，而經(jīng)過ASCs或AG處理后，裸鼠皮膚真皮層厚度顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖4～5。

馬松染色組織學觀察結(jié)果顯示，在顯微鏡下可以看到位于皮膚真皮層有大量的束狀排列的膠原纖維。染色膠原纖維呈現(xiàn)藍色，而肌纖維則呈現(xiàn)紅色。與對照組相比，D-半乳糖致衰老模型組的膠原分布比明顯降低，而經(jīng)過ASCs或AG處理后，裸鼠膠原分布比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖5～6。

2.5 四組CD31及VEGF水平比較：相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠CD31及VEGF表達量顯著降低，而通過ASCs或AG處理的裸鼠CD31及VEGF表達量有所改善。見圖7～8。

2.6 四組總膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平比較：相較于對照組，D-半乳糖+PBS組裸鼠總膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平顯著降低，而通過ASCs或AG處理的裸鼠各指標水平均有所改善。

3 ?討論

皮膚衰老主要與真皮層中纖維細胞的減少以及細胞生物學功能的降低有關。皮膚的真皮結(jié)構(gòu)老化主要表現(xiàn)在真皮消除外部物質(zhì)的能力降低，真皮層厚度變薄，以及膠原分解的增多，膠原合成的減少，以及分解酶活性的增強[12]。目前，自體脂肪組織被認為是最好的軟組織填充材料之一。作為脂肪組織移植的一種理想細胞，ASCs已經(jīng)被證實為在抵抗衰老，修復軟組織損傷以及提高移植性脂肪的成活率方面具有顯著效果[13]。已有研究表明，ASCs可促進脂肪組織的更新[14];脂肪細胞的壽命通常是2～10年，ASCs來源的細胞可以作為死亡的脂肪細胞的替代細胞。隨著年齡的增加，脂肪組織可能會逐漸萎縮，其原因可能為ASC生成的逐漸減少，以及可再生性組織的不斷弱化。Kim等[15]以及Lee等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，ASCs的上清液可加速在真皮內(nèi)層的成纖維細胞的增殖以及Ⅰ型膠原的分泌，同時還具有降低成纖維細胞的凋亡能力。此外，ASCs的注射可減少由紫外線B（UVB）而導致的小鼠皮膚皺紋，并增加膠原蛋白的含量和真皮的厚度。

本研究中，通過HE染色及馬松染色結(jié)果顯示，D-半乳糖的注射，可能會導致皮膚真皮層變薄，并使膠原分泌減少。而ASCs可以逆轉(zhuǎn)由D-半乳糖誘發(fā)的小鼠的真皮層厚度和膠原分泌的變化。而ELISA結(jié)果顯示，ASCs可改善由D-半乳糖誘發(fā)的小鼠總膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白的分泌。既往研究表明，脂肪干細胞能夠分泌膠原蛋白[17]，但是仍認為，ASCs主要功能是通過旁分泌機制加快成纖維細胞增殖和膠原蛋白的產(chǎn)生，從而增加膠原蛋白的含量和真皮層厚度;移植后的脂肪干細胞能夠刺激成纖維細胞分泌并合成膠原，同時刺激分泌大量的新的細胞外基質(zhì)，從而修復真皮原有的彈性纖維，重建肌膚結(jié)構(gòu)，同時能夠增加真皮厚度，增加皮膚彈性，改善皮膚紋理。

MDA是一類性質(zhì)活躍的交聯(lián)劑，其能與磷脂酰乙醇胺迅速反應并產(chǎn)生熒光色素，然后進一步形成含有蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)的層狀脂褐質(zhì)，沉積在細胞和組織中。這類物質(zhì)會導致機體各種生物大分子功能結(jié)構(gòu)的異常，并破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，最終導致身體老化。機體中，與老化相關的酶如SOD和谷胱甘肽過氧化物酶可相互調(diào)節(jié)以消除機體內(nèi)過多的自由基并減少脂質(zhì)過氧化物MDA的產(chǎn)生。但隨著年齡的增長，SOD的活性不斷降低，從而導致MDA的含量不斷增加。目前研究中，SOD的活性及MDA含量已作為反映機體衰老指標之一[18-19]。本研究中，經(jīng)過D-半乳糖誘導后，SOD的活性明顯降低，而MDA的水平則顯著提高;而通過 ASC移植后，SOD的活性則得到明顯的升高，MDA的水平則明顯降低。而且經(jīng)過ASCS處理后，老化的裸鼠的精神狀態(tài)得到改善，其皮膚光澤也得到了恢復。這提示ASCs移植具有一定的抗衰老能力。

糖基化是膠原中游離氨基之間的一種非酶反應，也是氧活化基團誘導的氧化反應。當機體受到外界物質(zhì)的刺激時，膠原中的氨基酸往往被暴露，進而導致細胞外液的氨基酸和葡萄糖之間產(chǎn)生非酶糖基化，從而產(chǎn)生新的殘留物即晚期糖基化終末產(chǎn)物。隨著晚期糖基化終末產(chǎn)物的增加，膠原形成分子間的交聯(lián)，結(jié)締組織的通透性降低，組織的延展性和硬度增加并且膠原的含量逐漸降低，最終誘發(fā)真皮層變薄，皮膚彈性的減弱，從而加速機體的衰老。本研究結(jié)果顯示，脂肪干細胞的移植可以有效地抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而拮抗糖基化。

目前，也有研究認為ASCs的抗衰老機制是促進血管的生成。大量證據(jù)表明，脂肪干細胞能夠通過分泌的VEGF以及肝細胞生長因子來加速組織血管的生成[20-21]。本研究結(jié)果表明，ASCs能夠通過分泌VEGF而誘導皮膚組織血管的生成，而CD31免疫組化染色結(jié)果也進一步證實了ASCs可以為皮膚組織提供營養(yǎng)物。

綜上所述，ASCs可以提高抗氧化酶的活性，并減少脂質(zhì)過氧化物的生成，促進膠原蛋白的分泌，同時還可逆轉(zhuǎn)D-半乳糖誘導產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物的過度生成。酶活性以及晚期糖基化終末產(chǎn)物的變化可能與某些功能細胞以及缺乏及時更新的干細胞的衰老和功能減退相關。雖然具體的機制并不清楚，但是認為，脂肪干細胞可以通過以下的機制修復或重建組織，這些機制為：首先，ASCs以類似于間充質(zhì)干細胞的形式移植到皮膚組織，其可以通過旁分泌而分泌細胞生長因子，進而刺激細胞修復;其次，ASCs可以為需要修復的皮膚組織提供抗氧化劑和自由基清除劑，從而消除在局部環(huán)境中釋放的有毒物質(zhì)，加速活性細胞的修復，并將這些細胞分化成功能細胞以替換老化的功能細胞，從而保持機體平衡。

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[收稿日期]2019-05-31

本文引用格式：魏姝玥，王海英，李愛蘭，等.脂肪干細胞對D-半乳糖致裸鼠皮膚老化的拮抗作用及對皮膚恢復功能的影響[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（1）：62-67.