辛伐他汀對SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究

陳俊偉 李帆 楊艷清

[摘要]目的：建立重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠增生性瘢痕模型，并觀察辛伐他汀乳膏外用對瘢痕的抑制作用。方法：取4周齡SCID小鼠12只，將手術(shù)切除的人類瘢痕組織皮片移植到其背部，1周后將小鼠隨機分為3組，分別為模型組、乳膏基質(zhì)組和1%辛伐他汀乳膏組，連續(xù)外用藥物2周后，取各組移植瘢痕組織行HE染色、Masson染色;堿水解-分光光度法檢測瘢痕組織中羥脯氨酸（HPr）含量。結(jié)果：植皮后1周，鼠背可觀察到黃褐色、隆起于皮面、質(zhì)地柔韌的類瘢痕組織，組織病理學(xué)可見排列紊亂的粗大膠原束，呈結(jié)節(jié)狀或漩渦狀排列，符合增生性瘢痕的特點。外用1%辛伐他汀乳膏2周后，真皮纖維化程度較模型組有所緩解，膠原含量減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：SCID鼠增生性瘢痕模型類似于人類增生性瘢痕，1%辛伐他汀乳膏可抑制該動物模型瘢痕組織增生。

[關(guān)鍵詞]辛伐他汀;SCID小鼠;增生性瘢痕;纖維化

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）01-0055-03

Inhibitory Effect of Simvastatin on Hypertrophic Scar Model of SCID Mice

CHEN Jun-wei，LI Fan，YANG Yan-qing

（Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Wuhan，Tongren Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective ?To investigate the inhibitory effect of simvastatin cream on established hypertrophic scar model of severe combined immunodeficiency （SCID） mice. Methods ?Human split-thickness skin grafts of hypertrophic scar were transplanted onto the dorsum of 12 four weeks old SCID mice. After one week， the mice were randomly divided into 3 groups： model control group， vehicle only group and 1% simvastatin cream group. After two consecutive weeks of treatment， the hypertrophic scar xenografts were harvested and given biopsy for histology by HE and Masson staining. Besides， alkaline hydrolysis-spectrophotometry was used to determine the level of hydroxyproline in hypertrophic scar xenografts. Results ?After one week of transplantation， the xenografts showed characteristic human hypertrophic scar including a yellowish brown， firm and elevated appearance. Histopathology showed disordered thick collagen fibrils arranged in nodular or whirlpool shape. After two weeks treatment of 1% simvastatin cream， the dermal fibrosis was alleviated and collagen content was decreased compared with model control group， the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion ?The hypertrophic scar model of SCID mice is similar to that of human hypertrophic scar and 1% simvastatin cream could inhibit the scar development in this animal model.

Key words： simvastatin; SCID mice; hypertrophic scar; fibrosis

人體皮膚組織損傷后過度修復(fù)可發(fā)生增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS），由于其具體的分子生物學(xué)機制尚不清楚，目前臨床中并無特異性根治方法。近些年來常用的方法有手術(shù)、激光、藥物局部注射和放射治療等，但是存在治療周期長、復(fù)發(fā)率高和個體差異大等問題，且選擇單一的治療方法通常無法達到滿意的效果[1]。因此，迫切需要開發(fā)一種新型的治療藥物，單獨使用或與當前的治療手段相結(jié)合，從而在對患者損傷最小的前提下，達到最佳的治療效果。

辛伐他?。⊿imvastatin）是一種羥甲基戊二?；o酶A（HMG-ConA）還原酶抑制劑，用于治療高膽固醇血癥，近來有報道辛伐他汀可減少兔耳增生性瘢痕的形成[2]。體外實驗發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促進其凋亡[3]。重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（Severe combined immunodeficiency mouse， SCID小鼠）是一種純合子基因突變鼠，其細胞免疫和體液免疫功能均有缺陷，可作為人類皮膚移植的理想受體[4]。本次通過構(gòu)建SCID小鼠增生性瘢痕模型，驗證該模型的可行性，并進一步探討辛伐他汀治療的可能性與分子機制。

1 ?材料和方法

1.1 主要試劑：辛伐他汀原藥粉購于美國Calbiochem公司（CAS號：79902-63-9），1%辛伐他汀乳膏和乳膏基質(zhì)由武漢大學(xué)同仁醫(yī)院藥劑科自制，Masson染色試劑盒購于福州邁新公司，羥脯氨酸試劑盒購買于南京建成生物工程研究所。4周齡雌性SCID Beige小鼠（質(zhì)量合格證編號：11400700230963）購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心SPF級實驗室。

1.2 模型制備、動物分組和藥物處理：參照文獻[5-7]報告的方法構(gòu)建動物模型。移植人類瘢痕組織來源于武漢大學(xué)同仁醫(yī)院整形科瘢痕畸形整復(fù)術(shù)中切除的皮膚組織。術(shù)中征得患者知情同意，本研究通過武漢大學(xué)同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。將切取的瘢痕組織盡量去除皮下脂肪，修剪為1cm×1.5cm的長方形皮片，生理鹽水紗布包裹，快速低溫送至動物房備用移植。SCID小鼠隨機分為3組，模型組（皮片移植）、乳膏基質(zhì)組（皮片移植+外擦乳膏基質(zhì)）、1%辛伐他汀組（皮片移植+外擦辛伐他汀乳膏），每組4只。給予SCID小鼠七氟醚吸入麻醉，對其背部進行脫毛，消毒后剪開至筋膜層，使用可吸收縫線將備用皮片縫合，邊緣仔細對合，術(shù)后將小鼠分籠飼養(yǎng)。造模1周后，乳膏基質(zhì)組與辛伐他汀組分別外用乳膏基質(zhì)與1%辛伐他汀乳膏，每日2次，連用2周。

1.3 組織學(xué)病理檢查：外用藥物2周后處死小鼠，將背部移植瘢痕組織連帶周圍部分正常鼠皮一同取下。經(jīng)過4%多聚甲醛固定后24h，石蠟包埋并制備5μm厚的切片，之后分別進行HE染色及Masson染色。正置顯微鏡下觀察并攝取圖片。主要觀察以下指標：①瘢痕組織形態(tài);②膠原形態(tài)及排列。每張切片隨機選取3個200倍放大的視野，使用Olympus機載顯微圖像數(shù)字化分析軟件測量各個組的真皮厚度。

1.4 瘢痕組織羥脯氨酸（HPr）含量測定：動物組織中HPr的測定可用來反映皮膚總膠原的含量。參照試劑盒的說明書，使用NaOH將組織中HPr多肽水解為游離的HPr，經(jīng)過氧化反應(yīng)可生成紅色的吡咯化合物。約50g瘢痕組織經(jīng)過勻漿、消化和水解等步驟，取上清后于分光光度計550nm處測量各管的吸光度值。皮膚總膠原含量（mg/g）=HPr（mg/g）/12.5%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量資料使用均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，處理組與模型組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 增生性瘢痕模型觀察：植皮后1周，移植瘢痕皮片組織與小鼠周圍正常皮膚基本對接，顏色為蠟黃色，質(zhì)地柔軟，周圍可見灰褐色邊界（見圖1）。

2.2 HE染色結(jié)果：模型建造成功后開始用藥，2周后取組織行HE染色。從HE染色結(jié)果中可見，瘢痕組織與周圍鼠皮幾乎完全連接。因小鼠表皮與真皮較薄，真皮下可見脂肪組織，有明顯毛囊結(jié)構(gòu)，組織學(xué)結(jié)果中可清晰分界小鼠皮膚與人類瘢痕組織。模型組瘢痕組織真皮內(nèi)可見大量膠原纖維束，排列致密、紊亂、紅染，呈漩渦狀或結(jié)節(jié)狀，符合增生性瘢痕的組織病理學(xué)表現(xiàn)。乳膏基質(zhì)組較模型組無明顯差異。1%辛伐他汀組與模型組相比膠原纖維有所減少，染色強度減弱（見圖2）。

2.3 Masson染色結(jié)果：Masson染色可更加清晰顯示真皮層纖維化程度。模型組與乳膏基質(zhì)組染色結(jié)果顯示，真皮層可見大量致密深染的粗大膠原纖維，1%辛伐他汀組著色程度有所下降，纖維化程度降低，膠原纖維含量有所減少，染色強度減弱（見圖3）。

2.4 真皮厚度及皮膚總膠原含量測定：通過測定羥脯氨酸的含量可反映皮膚總膠原的含量。治療2周后，乳膏基質(zhì)組與模型組相比，總膠原含量及真皮厚度無明顯改變（P>0.05）。1%辛伐他汀組與模型組相比，總膠原含量明顯減少（P<0.01），但兩組間真皮厚度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 ?討論

皮膚作為人體最大的器官構(gòu)成防御外界刺激的第一道屏障，當皮膚受到深達真皮層的創(chuàng)傷后，成纖維細胞過度增殖并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)可形成增生性瘢痕，由于其發(fā)生的具體分子機制尚無定論，目前暫無令人滿意的預(yù)防或治療策略。合適的動物模型對于疾病的科學(xué)研究至關(guān)重要，不僅為探索其病理發(fā)展過程提供基礎(chǔ)，更可在一定程度上縮短新藥的研發(fā)進程。由于不同種系的特異性，實驗動物的普通創(chuàng)面愈合過程通常較快且無明顯瘢痕形成。中國學(xué)者李薈元等于1998年首先建立了兔耳增生性瘢痕模型，并觀察了不同形狀和深度的創(chuàng)面對此模型中瘢痕組織膠原含量、組織病理及蛋白表達等指標的影響，對后期國內(nèi)學(xué)者研究增生性瘢痕模型具有開創(chuàng)性的意義[8-9]。該兔耳模型組織病理主要為成纖維細胞增殖及膠原沉積，類似人體增生性瘢痕。由于兔耳與人體皮膚組織結(jié)構(gòu)存在差異，有學(xué)者觀察到兔耳軟骨組織受創(chuàng)與該模型有一定關(guān)聯(lián)，這種改變與人體增生性瘢痕的形成存在差別[10-12]。在本實驗嘗試將人類瘢痕組織皮片移植至SCID小鼠背部，并驗證該增生性瘢痕動物模型的可行性。SCID小鼠由于細胞免疫和體液免疫均存在缺陷，對異物的排斥反應(yīng)明顯降低，可作為人體組織移植的理想受體[4]。研究表明，SCID小鼠與目前國內(nèi)應(yīng)用較多的裸鼠相比，前者更適宜建立腫瘤移植動物模型，移植成功率高于后者[13-14]。本次觀察了人類皮膚增生性瘢痕組織移植到SCID小鼠背部后，瘢痕組織的存活情況并行組織學(xué)活檢，結(jié)果表明，術(shù)后1周，移植皮膚瘢痕組織質(zhì)地柔軟，顏色有所加深，邊緣呈灰褐色且輕度高出皮面。術(shù)后3周取皮損行組織病理學(xué)觀察，可見人體皮膚組織與周圍鼠皮緊密連接，且符合增生性瘢痕的膠原分布特點，進一步證實了該小鼠瘢痕模型的可行性。然而，本實驗中觀察到，SCID小鼠背部移植的瘢痕組織在3周后開始萎縮消退，周圍正常鼠皮逐漸向移植區(qū)擴大并最終將其完全替代，這與增生性瘢痕組織在人類皮膚上長期存在且數(shù)年無消退不相符，考慮與瘢痕組織所處的微環(huán)境發(fā)生改變有關(guān)，且SCID小鼠免疫系統(tǒng)缺陷影響了瘢痕組織的發(fā)展演變過程，后期擬通過將瘢痕組織皮下埋植或皮膚牽張器干預(yù)等方法改善此動物模型，以期延長移植瘢痕組織的存活時間。

在創(chuàng)傷愈合過程中，促進或抑制纖維化的細胞因子相應(yīng)地表達增高或者減低，正常的膠原合成與降解穩(wěn)態(tài)被破壞，大量膠原合成并堆積于真皮層，形成了增生性瘢痕的基本病理改變[15]。其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是瘢痕形成中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，在瘢痕的增殖期其受體表達明顯增強，信號通路被激活引起細胞外基質(zhì)大量分泌[16]。目前臨床上已證實有效的藥物有激素類、鈣離子拮抗劑、抗腫瘤藥物等[17]。此外，有研究表明，辛伐他汀可阻斷TGF-β1/Smad2，3信號通路，抑制成纖維細胞Ⅰ型膠原的產(chǎn)生[18]。低氧條件下，辛伐他汀還可抑制瘢痕組織成纖維細胞增殖并促進其凋亡[19]。此外，有學(xué)者通過機械損傷在兔耳廓部構(gòu)建增生性瘢痕，觀察到局部瘢痕內(nèi)注射他汀類藥物可抑制兔耳瘢痕組織發(fā)展[20]。本次將人類瘢痕組織植入SCID小鼠背部建立增生性瘢痕模型，觀察外用辛伐他汀對該模型的影響。Masson染色結(jié)果表明，經(jīng)1%辛伐他汀乳膏局部治療2周后，瘢痕組織的纖維化程度和范圍與模型組相比明顯減小。此外，真皮厚度也有所變薄。羥脯氨酸作為膠原合成的特有原料，含量恒定，其數(shù)值可反應(yīng)皮膚的總膠原含量。實驗發(fā)現(xiàn)辛伐他汀外用2周后，皮膚總膠原含量顯著低于模型組，表明辛伐他汀通過抑制膠原沉積可起到治療瘢痕的作用。

綜上所述，將瘢痕組織移植到SCID小鼠背部可模擬人類增生性瘢痕，為研究增生性瘢痕的發(fā)展演變過程及篩選治療手段提供科研基礎(chǔ)。辛伐他汀通過調(diào)節(jié)真皮纖維化、影響真皮層厚度及抑制膠原合成發(fā)揮治療瘢痕的作用。然而，本研究中建立的動物模型瘢痕組織存活時期較短，仍需進一步改善。目前，辛伐他汀對瘢痕的體內(nèi)治療作用均局限于動物模型，仍需嚴格的藥物臨床試驗來驗證其有效性和安全性。

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[收稿日期]2019-07-22

本文引用格式：陳俊偉，李帆，楊艷清.辛伐他汀對SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（1）：55-58.