HBV 前S1編碼鏈鎖核酸的設(shè)計及體外抗HBV效果觀察

彭彬 許桂丹 韋武均 農(nóng)順強(qiáng) 陳曉昊 肖樹榮 潘柳葉 鄧益斌

【摘要】 目的 針對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）前S1 dsDNA同聚嘌呤區(qū)設(shè)計反基因寡核苷酸藥物-鎖核酸（locked nucleic acid，LNA），并在體外觀察抑制HBV復(fù)制的效果。

方法 針對HBV前S1 dsDNA的3023～3037 nt、3094～3109 nt兩個同聚嘌呤區(qū)，利用RNA structure軟件分別設(shè)計并合成LNA，以陽離子脂質(zhì)體為載體，將藥物轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)，采用熒光定量PCR技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)分別檢測3 d、6 d和9 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA和HBsAg的含量;CCK8法檢測鎖核酸對HepG2.2.15細(xì)胞代謝的影響。

結(jié)果 LNA對HepG2.2.15細(xì)胞的HBV DNA轉(zhuǎn)錄和HBsAg表達(dá)有顯著的抑制作用，并且抑制效果隨著時間進(jìn)一步加強(qiáng)，在第9天的抑制率分別為45.37%和52.09%。兩個同聚嘌呤組與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而封閉3023～3037nt同聚嘌呤區(qū)的LNA抑制作用較強(qiáng)，且最適序列長度為15～25 bp。CCK8實驗顯示LNA對HepG2.2.15細(xì)胞無任何明顯的代謝影響。

結(jié)論 針對前S1 dsDNA同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸分子在體外能夠有效地抑制HBV的復(fù)制，以封閉3023～3037 nt靶位效果較強(qiáng)，且合適序列長度為15～25 bp。

【關(guān)鍵詞】 反基因寡核苷酸藥物;乙型肝炎病毒;鎖核酸;反基因治療

中圖分類號：R73 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.02.003

【Abstract】 Objective To design an antisense oligodeoxynucleotide，a locked nucleic acid，against the pre-S1 dsDNA homopolyfluoride region of hepatitis B virus（HBV），and observe the inhibition effect of HBV replication in HepG2.2.15 cells.

Methods The two polymorphic regions of 3023-3037 nt and 3094-3109 nt of pre-S1 dsDNA of hepatitis B virus were designed and synthesized by RNA structure software.The transfected HepG2.2.15 cells were mediated by cationic liposome.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR） and chemiluminescence immunoassay were used to detect the content of HBV DNA and HBsAg in cell culture supernatants at 3，6 and 9 days，respectively.The effect of LNA on the metabolism of HepG2.2.15 cells was detected by CCK8 method.

Results LNA significantly inhibited HBV DNA replication and HBsAg expression in HepG2.2.15 cells，and the inhibition rate increased with time.After 9 days，the inhibition rates were 45.37% and 52.09%，respectively.The difference between the experimental group and the control group was statistically significant （both P<0.05），while the blocking effect of LNA in the 3023-3037 nt polypyrogenic region was stronger，and the optimal sequence length was 15-25 bp.LNA has no significant metabolic effect on cells.

Conclusion The anti-gene-locked nucleic acid molecule targeting the pre-S1 dsDNA homomeric region can effectively inhibit the replication of HBV in vitro，and the effect of blocking the target of 3023-3037 nt is strong，and the suitable sequence length is 15-25 bp.

【Key words】 antisense oligodexymucleotide;hepatitis B virus;locked nucleic acid;antigene therapy

鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）是近年來被人們發(fā)現(xiàn)的核苷酸衍生物，1994年，Rodriguez等在發(fā)酵副產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)LNA。四年后，Koshkin等[1]對LNA進(jìn)行了第一次合成與雜交試驗，隨后，Wang等[2～3]進(jìn)一步報道了LNA相關(guān)結(jié)構(gòu)與性能的實驗。目前發(fā)現(xiàn)，鎖核酸在反基因治療應(yīng)用中有著非常好的效果，與其他的寡核苷酸相比，鎖核酸具有以下優(yōu)點：（1）LNA單體結(jié)合到寡核苷酸鏈中可以顯著地提高解鏈溫度，在與DNA、RNA互補(bǔ)成為雙鏈時可以提供很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，每引入一個LNA單體，可以使解鏈溫度提高3℃[4～6];（2）LNA因其特殊結(jié)構(gòu)，能夠具備抗3脫氧核苷酸酶降解的能力，抗酶解能力強(qiáng)[7～9];（3）LNA與DNA、RNA的結(jié)合可以對目的基因進(jìn)行調(diào)控或者抑制，同時又可以被Rnase H識別，從而對mRNA進(jìn)行降解[10～13];（4）LNA在與DNA、RNA結(jié)合時，具有出色的錯配辨別力[14];（5）脂溶性好[15];（6）半衰期長[16]。因此，為了觀察鎖核酸是否能夠抑制HBV DNA的復(fù)制和HBsAg的表達(dá)，本研究針對HBV preS1 dsDNA兩個同聚嘌呤區(qū)分別設(shè)計并合成鎖核酸序列，以脂質(zhì)體介導(dǎo)為載體，將反基因藥物轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞株，并進(jìn)一步觀察其抗乙肝病毒效果，為尋找新的乙肝病毒靶點和設(shè)計新型抗乙肝病毒藥物提供現(xiàn)實依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG 2.2.15細(xì)胞是Hep2細(xì)胞在染色體上整合了HBV基因組的肝腫瘤細(xì)胞株，能夠在細(xì)胞上清液穩(wěn)定表達(dá)HBsAg、HBeAg、HBV DNA等物質(zhì)，由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科許桂丹碩士惠贈，右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心常規(guī)培養(yǎng)于含G418、1%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，37℃、50 mL/CO2條件下;高糖型DMEM培養(yǎng)基、G418、胎牛血清等購自GIBCO公司;LipofectamineTM 3000購自美國Invitrogen公司;熒光定量PCR檢測HBV DNA試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司;乙型肝炎病毒HBsAg定量檢測試劑盒購自鄭州安圖生物工程股份有限公司;化學(xué)發(fā)光免疫測定儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司;實時定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 反基因鎖核酸的合成與修飾

從NCBI基因庫中搜索到HBV ayw亞型全基因組序列（3.2 kb DNA，NC：003977.1，GI：21326584），利用RNA structure 6.0軟件針對編碼鏈的3023～3037 nt、3094～3109 nt兩個同聚嘌呤區(qū)分別設(shè)計1條長度不等的反基因寡核苷酸序列：（1）3023～3037 nt同聚嘌呤區(qū)：5CA*AA*TGCT*CCCGCT*C 3（15pb）;（2）3094～3109 nt同聚嘌呤區(qū)：5T*GT*TGTCA*ATAT*GCC 3（15pb）。以上各序列中，標(biāo)注*號的前一個堿基進(jìn)行鎖核酸（LNA）修飾。各序列經(jīng)BLAST排除與人同源后由上海生物工程有限公司合成修飾并純化。

1.2.2 實驗分組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

本實驗設(shè)藥物組和空白組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞）。實驗組包括：（1）互補(bǔ)3023～3037 nt同聚嘌呤區(qū)序列：LNA-脂質(zhì)體組;（2）互補(bǔ)3094～3109 nt同聚嘌呤區(qū)序列：LNA-脂質(zhì)體組。將HepG 2.2.15細(xì)胞按1×105個/mL接種于6孔板培養(yǎng)板中，每孔最終稀釋量為 2 mL，實驗組為兩個，即3023～3037 nt同聚嘌呤區(qū)組，3094～3109 nt同聚嘌呤區(qū)組，每組復(fù)孔按照數(shù)字隨機(jī)表各設(shè)6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁達(dá)50%～60%后分別在各組的每個復(fù)孔中加入用脂質(zhì)體包裹著的反基因藥物，分別在3 d、6 d、9 d[17]收集各孔培養(yǎng)上清液（-20℃保存?zhèn)溆茫?。轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體說明書操作。

1.2.3 培養(yǎng)上清液HBsAg含量測定

采用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測，每個樣品重復(fù)測量3次，嚴(yán)格按試劑盒說明書及儀器操作說明書操作，HBsAg濃度以IU/mL表示。

1.2.4 培養(yǎng)上清液HBV DNA含量測定

采用實時熒光定量PCR法檢測。取培養(yǎng)上清液500 μL于新的1.5 mL EP管中，高速離心后留200 μL，加450 μL DNA提取液及4 μL內(nèi)標(biāo)溶液，100℃恒溫處理15 min。按比例（HBV PCR反應(yīng)液27 μL/份+Taq酶3 μL/份）取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按30 μL/管分裝到PCR 八連管中，備用;往上述PCR反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別按量加入處理過的待測樣本核酸、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品及不同濃度的定量參考品的上清液各20 μL，蓋緊PCR管蓋后瞬時離心數(shù)秒后放置于熒光定量PCR儀中，擴(kuò)增條件：92℃預(yù)變性 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s共 10個循環(huán)，93℃ 30 s，55℃ 45 s 共30個循環(huán)，72℃終延伸5 min共1個循環(huán)。由計算機(jī)軟件自動分析所收集的熒光信號并計算出定量結(jié)果，采用計算對數(shù)平均值的方法計算HBV DNA平均拷貝數(shù)。并按以下公式計算抑制率：

抑制率=（N空白組-N實驗組N空白組×100%）。

1.2.5 鎖核酸對細(xì)胞毒性檢測

根據(jù)CCK8比色法操作說明書檢測反基因藥物鎖核酸對HepG2.2.15細(xì)胞代謝活性的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗，若方差不齊則用Games-Howell，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 封閉不同靶位的反基因鎖核酸抑制HBV DNA復(fù)制的效果

鎖核酸加入第3天后，HBV DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄即開始受到抑制，且抑制效果隨著時間推移進(jìn)一步升高。兩個實驗組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而封閉3023～3037 nt同聚嘌呤區(qū)的反基因LNA對HBV DNA復(fù)制的抑制效果最明顯。見表1。

2.2 封閉不同靶位的反基因鎖核酸抑制HBV DNA復(fù)制率

在反基因鎖核酸加入9 d后抑制率最高可以達(dá)到45.37%，兩個不同的靶區(qū)以3023～3037 nt同聚嘌呤區(qū)封閉效果最強(qiáng)。見表2、圖1。

2.3 反基因鎖核酸對乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達(dá)的抑制作用

反基因藥物鎖核酸加入第3天后，鎖核酸對HBsAg的表達(dá)開始發(fā)揮抑制作用，且抑制效果隨著時間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，兩個實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而3023～3037 nt靶區(qū)對HBsAg表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。見表3。

2.4 反基因鎖核酸對乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達(dá)的抑制率

反基因寡核酸藥物鎖核酸加入第3天后，LNA對HBsAg的表達(dá)開始發(fā)揮抑制作用，3023～3037 nt靶區(qū)對HBsAg表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。見表4、圖2。

2.5 CCK8比色法檢測鎖核酸對細(xì)胞代謝的影響

用藥第9天，采用CCK8比色法檢測鎖核酸組A 值為（2.209±0.006），對照組A 值為（2.207±0.008），比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示反基因藥物鎖核酸對HepG2.2.15細(xì)胞代謝基本無影響。

3 討論

含有前S1的蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，前S1蛋白在病毒侵入人體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程起到了非常重要的作用，是急性乙型肝炎的臨床診斷、療效觀察和預(yù)后的良好指標(biāo)。

因此，本研究針對HBV前S1 ds DNA編碼鏈的3023～3037 nt靶區(qū)和3094～3109 nt靶區(qū)兩個同聚嘌呤區(qū)設(shè)計合成1條序列長度不等的反基因鎖核酸分子，由LipofectamineTM 3000脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞株，通過檢測空白組和實驗組的HBV DNA和HBsAg含量等指標(biāo)來評價反基因鎖核酸分子的療效，實驗結(jié)果顯示，封閉3023-3037 nt靶區(qū)在體外抑制preS1 基因復(fù)制與表達(dá)的作用最強(qiáng)，抑制作用隨時間呈遞增趨勢，其中，在9 d的 HBV DNA抑制率是45.37%、HBsAg為 52.09%，這兩個序列長度相同，在同一實驗中，對乙肝病毒DNA、HBsAg的抑制效果以3023～3037 nt靶區(qū)最強(qiáng)，可能說明該區(qū)相對于3094～3109 nt靶區(qū)來說更加能夠有效地通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，識別并結(jié)合到HBV dsDNA的同聚堿基配對區(qū)形成三鏈雜交分子，能夠更加有效地對病毒靶基因的復(fù)制和表達(dá)起到抑制作用，具體機(jī)制尚未清楚，下一步實驗將針對該機(jī)制進(jìn)行研究， 為后面研究反基因鎖核酸在HBV治療上提供了重要的理論、實驗依據(jù)。此外，CCK8檢測結(jié)果證實鎖核酸對細(xì)胞的代謝活性無明顯毒性作用。

總之，通過對比preS1 dsDNA同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸分子的兩條序列，觀察HBV DNA、HBsAg等實驗指標(biāo)，以封閉3023～3037 nt靶區(qū)效果最強(qiáng)，且合適序列長度在15～25 bp之間，這為前S1的靶位提供了理論和實驗依據(jù)，也為HBV的藥物治療提供了有效的靶位。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-07-08 修回日期：2019-11-02）

（編輯：梁明佩）