鱘魚軟骨酶解條件優(yōu)化及酶解物的體外抗腫瘤活性

武瑞赟 杜怡麗 黃雨霞 李鵬飛 鄭海濤 李平蘭

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

癌癥也稱作惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。在癌癥治療的漫長(zhǎng)過程中，藥物的毒副作用明顯，已成為急需解決的問題。因此，研究與開發(fā)高效低毒的生物活性物質(zhì)成為研究的熱點(diǎn)。

目前研究較多的生物活性物質(zhì)為多糖類[3]、黃酮類[4]以及生物堿類[5]。長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為蛋白質(zhì)只有變成氨基酸才能夠被人體吸收，且僅僅能夠?yàn)槿梭w提供氮源和氨基酸[6]。然而已有研究證明，2～6個(gè)氨基酸組成的寡肽可被機(jī)體吸收和利用[7]；新的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體內(nèi)缺少一些調(diào)節(jié)生理功能的肽時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能的改變[8]，適當(dāng)補(bǔ)充某些生物活性肽如抗菌肽[9]、膠原多肽[10]等對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，促進(jìn)人體健康具有重要的作用。因此，新型生物活性肽類資源的挖掘受到廣泛關(guān)注，已成為近年來研究的又一個(gè)熱點(diǎn)。骨膠原多肽是膠原或者明膠經(jīng)過蛋白酶降解處理得到的產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的水溶性，易被機(jī)體吸收[11-12]，且具有抗氧化、抗腫瘤活性及抑制DPP-4酶等多種[13]功能。鱘魚(Sturgeon)是現(xiàn)存起源最早的硬鱗軟骨脊椎動(dòng)物之一[14]，除頭蓋骨外，其余全為軟骨，約占魚體的10%左右[15]。軟骨中富含蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中膠原蛋白占比很大。目前鱘魚骨作為加工副產(chǎn)物未進(jìn)行精深開發(fā)，主要用于飼料的生產(chǎn)，利用率低，附加值少。因此，研究與開發(fā)功能性的鱘魚骨膠原肽具有潛在的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

本研究擬采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶聯(lián)合使用的方法，對(duì)鱘魚骨制備骨膠原多肽的酶解條件進(jìn)行研究；利用細(xì)胞模型，考察骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制能力，并探究其對(duì)癌細(xì)胞中參與凋亡的關(guān)鍵酶活性的影響以及作用方式，以期為鱘魚骨膠原多肽功能研究及產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HeGp2、人肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所贈(zèng)予；人工養(yǎng)殖西伯利亞鱘和史氏鱘雜交鱘魚，北京市農(nóng)科院水產(chǎn)技術(shù)研究所十渡鱘魚繁育基地提供。

DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)，美國Corning公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(0.25%)，北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞增殖Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、細(xì)胞膜電位檢測(cè)試劑盒、caspase-1、caspase-3活力檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶(2.30×105IU/g)，中性蛋白酶(7.68×104IU/g)，購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶(1.00×105IU/g)，胰蛋白酶(2.50×105IU/g)，購自寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶(8.00×105IU/g)，購自寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司。L-亮氨酸，北京酷來搏科技有限公司；三氯乙酸，牛血清蛋白，碳酸鈉，酒石酸鉀鈉，硫酸銅，F(xiàn)olin-酚乙液，上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；四硼酸鈉，西隴科學(xué)股份有限公司；5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，武漢制藥集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平FA1004，上海天平儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)UV-1800，上海美譜達(dá)儀器有限公司；pH計(jì)EF28，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器IT-07A-3，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；微量臺(tái)式離心機(jī)Sorvall Legend Micro 17，賽默飛世爾科技公司；Imark酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1鱘魚軟骨粉制備

鱘魚軟骨經(jīng)煮沸剔除殘留肉渣后，浸泡于95%乙醇中脫脂后晾干，經(jīng)24 h冷凍干燥后磨粉制得所需的鱘魚軟骨粉。

1.3.2鱘魚骨酶解物肽得率測(cè)定

將三氯乙酸(TCA)沉淀法與 Folin-酚法結(jié)合測(cè)定肽得率。

取原溶液及酶解液各5 mL，加入5 mL 30%的TCA，靜置20 min 后4 000 r/min離心15 min，取 1 mL 稀釋一定倍數(shù)的上清液，加入5 mL Folin-酚甲液后混勻。在25 ℃條件下保溫10 min，之后加入0.5 mL Folin-酚乙液并且立刻振蕩均勻，在 25 ℃ 條件下保溫30 min，保溫結(jié)束后測(cè)定500 nm的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出樣品中多肽的含量。肽得率即酶解得到的多肽與原樣品中總的肽含量的比值，計(jì)算公式為：

1.3.3蛋白酶種類篩選

選取5種酶解魚骨常用酶，以肽得率為考察指標(biāo)，在各酶理論最適酶解條件(表1)下處理鱘魚軟骨粉，選出適宜的酶種類。

表1 各酶理論最適酶解條件Table 1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis by theory

以骨粉與水質(zhì)量比為1∶25將骨粉溶于去離子水中，分別取相同體積的骨溶液，按表1條件各添加1×105IU/g的相應(yīng)蛋白酶，酶解3 h后置于沸水中滅酶10 min，經(jīng)4 000 r/min，10 min離心收集上清液，測(cè)定鱘魚軟骨粉酶解液中肽含量。

1.3.4單因素試驗(yàn)

在堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比為1∶1的條件下，以酶解時(shí)間(1、3、5、7、9 h)、酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)、骨粉與水質(zhì)量比(1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45)、加酶量(0.5×105、1×105、1.5×105、2×105、2.5×105IU/g)為變量，研究不同酶解條件對(duì)鱘魚骨肽得率的影響，然后固定以上最優(yōu)條件，考察堿性蛋白酶與中性蛋白酶在不同的酶活力比下對(duì)肽得率的影響。酶解時(shí)先加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH至8.0(堿性蛋白酶最適pH)，經(jīng)過一半時(shí)間后加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0(中性蛋白酶最適pH)。

1.3.5酶解條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

在蛋白酶初篩試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇肽得率最高的兩種酶對(duì)鱘魚軟骨粉進(jìn)行酶解，選擇加酶量、骨粉與水質(zhì)量比、酶解時(shí)間、酶解溫度和堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比5個(gè)因素，以肽得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)5因素5水平L25(55)正交試驗(yàn)(表2)。用IBM SPSS Statistics.V22設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并進(jìn)行方差分析。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Orthogonal test factors and level table

1.3.6細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速置于37 ℃水浴中，不斷搖動(dòng)細(xì)胞凍存管快速解凍。將解凍后的細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，加入DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至無菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80 %以上，進(jìn)行傳代，傳至3 代以上后用于試驗(yàn)。

細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，輕輕吹打使其分散成單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)/孔；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁過夜培養(yǎng)；棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，處理組每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的鱘魚骨膠原多肽(50、100、200、400、800、1 000 μg/mL)，另設(shè)不添加任何受試物只加有細(xì)胞的對(duì)照組和不加細(xì)胞的空白組，同時(shí)設(shè)置50 μg/mL 5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)為陽性對(duì)照組。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6 個(gè)平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。藥物處理結(jié)束，每孔添加10 μL的CCK-8試劑，于37 ℃避光反應(yīng)4 h；用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，細(xì)胞抑制率(U)的計(jì)算公式如下：

式中：M處理、M對(duì)照、M空白分別為處理組、對(duì)照組和空白組于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度，nm。

1.3.7caspase-1、 caspase-3活力測(cè)定

細(xì)胞以5×105個(gè)/mL種于6 孔培養(yǎng)板中，在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁12 h后，加入不同質(zhì)量濃度的骨膠原多肽樣品，另設(shè)不加任何刺激物的對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌1次后，裂解細(xì)胞測(cè)定caspase-1、caspase-3活力。在冰浴條件下，加入細(xì)胞裂解液，冰浴裂解15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液。向收集好的上清液中加入底物，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀在405 nm測(cè)定吸光度。最終的caspase酶活力單位定義為每微克蛋白樣品在37 ℃、2 h內(nèi)作用于底物所產(chǎn)生的物質(zhì)的量。

1.3.8線粒體膜電位(JC-1)檢測(cè)

細(xì)胞以5×105個(gè)/mL種于6 孔培養(yǎng)板中，在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁12 h后，加入不同質(zhì)量濃度的骨膠原多肽樣品，另設(shè)不加任何刺激物的對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌1次后，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。吸除上清液，用JC-1染色緩沖液(1倍)洗滌2次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液后在475～520 nm處使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)量數(shù)據(jù)由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析檢測(cè)不同數(shù)據(jù)間是否存顯著差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取牛血清蛋白(BSA)配制成濃度為 250 μg/mL 的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，向各管試管中依次加入 Folin-酚甲液并混勻。將試管置于25 ℃保溫10 min，加入 Folin-酚乙液后立即振蕩混勻，在 25 ℃ 下保溫30 min，在500 nm下測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性方程為y=0.001 5x+0.017，相關(guān)性R2=0.998 8，表明線性關(guān)系良好。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.1 Standard curve of BSA

2.2 酶解鱘魚軟骨粉蛋白酶的篩選

蛋白酶解的主要目的是生成具有更多功能特性的肽類，但在蛋白酶解同時(shí)，會(huì)生成少量氨基酸。因而如何計(jì)算水解過程中多肽得率是廣泛關(guān)注的問題。三氯乙酸(TCA)作為一種蛋白質(zhì)沉淀劑可以沉淀蛋白質(zhì)以及較長(zhǎng)的肽段。蛋白質(zhì)的多肽鏈在酶解反應(yīng)中會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸被切成大小不等的片段，在TCA中的溶解指數(shù)就會(huì)增大。TCA溶解指數(shù)就特定的底物而言可以定性地反映蛋白質(zhì)的分裂情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽段的含量越高。試驗(yàn)將三氯乙酸(TCA)沉淀法與Folin-酚法結(jié)合測(cè)定肽得率，以多肽得率為指標(biāo)，探究適合鱘魚軟骨酶解的酶解條件。

首先分別測(cè)定了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶在其理論條件下酶解鱘魚軟骨粉蛋白的肽得率，結(jié)果見圖2。堿性蛋白酶在其理論酶解條件下酶解效果最好，酶解后肽得率可達(dá)(51.74±1.63)%，其次是中性蛋白酶(36.05±0.26)%，因此選擇堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為下一步研究用酶。

J，堿性蛋白酶；Z，中性蛋白酶；Y，胰蛋白酶；M，木瓜蛋白酶；W，胃蛋白酶。柱形上方不同字母表示在0.05水平上有顯著性差異，下圖同。
J，alkaline protease； Z，neutral protease； Y，trypsin； M，papain； W，pepsin. The letter above the column indicates that there is significant difference at 0.05 level. The same bellow.
圖2 蛋白酶酶解肽得率
Fig.2 Determination of the yield of peptidyl hydrolyzed by protease

2.3 單因素試驗(yàn)

采用控制變量的方法，探究不同因素對(duì)肽得率的影響，以期為正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取加酶量(A)、料液比(B)、酶解時(shí)間(C)、酶解溫度(D)和堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比(E)5個(gè)因素，每個(gè)因素5個(gè)水平，以酶解后骨膠原多肽得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L25(55)正交試驗(yàn)確定制備鱘魚骨膠原多肽各因素的最佳條件。

圖3 酶解條件對(duì)鱘魚骨膠原多肽得率的影響
Fig.3 Effect of hydrolysis on the yield of sturgeon bone collagen polypeptide

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果
Table 3 Orthogonal test scheme and results

試驗(yàn)號(hào)Test number因素水平 FactorABCDE肽得率/%Peptide yield12251232.70±0.6025521562.60±0.8033452166.01±0.6645243172.24±0.4751555351.27±1.0865354482.98±0.3372145460.07±0.4383235557.12±1.1093124236.75±0.61101111142.15±0.69114153568.03±1.29124214355.56±1.42132534164.07±1.01141444553.95±0.31155132373.53±0.96163341365.58±1.12174431464.53±1.45181333234.31±0.13193513446.98±0.32201222437.12±0.24212423351.07± 0.09224325160.76±1.14232312550.01±1.18245415232.19±1.61254542239.02±0.66K1218.8280.53206.89247.56295.23K2247.92232.04248.30265.69174.97K3272.44283.64293.56283.63297.01K4297.9267.75290.86293.31301.68K5333.54273.94320.99271.41301.71R16.815.8922.305.9124.14

注：A、B、C、D、E為試驗(yàn)因素，具體含義見表2，下表同。

Note:A,B,C,DandEare the test factors and the specific meaning is shown in
Table 2. The same in the following table.

正交試驗(yàn)方案及極差分析結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3極差分析中R值比較可知，影響肽得率的因素順序?yàn)镋>C>A>D>B，即堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活比>酶解時(shí)間>加酶量>酶解溫度>骨粉與水質(zhì)量比。由表4極差分析中K值可初步得到各因素最優(yōu)水平分別為A5B3C5D4E5，由方差分析結(jié)果可知，A、C、E這3個(gè)因素對(duì)肽得率具有極顯著影響(P<0.01)，B、D兩因素對(duì)其影響不顯著(P>0.05)。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

2.4.2骨膠原肽最佳酶解條件的驗(yàn)證

結(jié)合酶解條件正交試驗(yàn)的極差及方差分析結(jié)果，考慮到復(fù)合酶酶解中多種酶會(huì)在蛋白中產(chǎn)生多種作用位點(diǎn)，相比單酶反應(yīng)，能夠得到更多多肽，最優(yōu)酶解工藝為A5B3C5D4E5，即加酶量1.5×105IU/g、骨粉與水質(zhì)量比1∶25、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度55 ℃、堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶活比為1∶2時(shí)酶解。該條件下測(cè)得肽含量為(72.36±2.33)%。

2.5 鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞增殖活性的影響

對(duì)于毒性小、高活性的天然抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)一直是研究熱點(diǎn)。在這些研究中，研究者們?cè)u(píng)價(jià)抗腫瘤活性所使用的細(xì)胞種類很多，包括結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29，DLD-1)，乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87)，前列腺癌細(xì)胞(PC-3，DU-145，H-1299)，胃癌細(xì)胞(AGS)與宮頸癌細(xì)胞(HeLa)等[19-20]。Gouic等[21]從金槍魚蛋白酶解物中分離得到肽，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7的增殖具有明顯的抑制作用。賈盈露等[22]利用酶解法，從沙蠶中分離純化出多肽PAP，并發(fā)現(xiàn)PAP可以抑制人肺癌細(xì)胞A549的增殖。

本研究利用CCK-8試劑盒測(cè)定并計(jì)算不同質(zhì)量濃度(ρ)的骨膠原多肽以及5-FU分別作用于5株癌細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖4。不同質(zhì)量濃度的骨膠原多肽對(duì)5種癌細(xì)胞都存在一定的抑制作用，尤其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco-2以及人肺癌細(xì)胞A549，骨膠原多肽都在一定程度上降低了細(xì)胞的存活率，且抑制率呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，最大抑制率陽性對(duì)照5-FU的抑制率，說明鱘魚骨膠原多肽具有抑制細(xì)胞增殖的潛力。

圖4 鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響
Fig.4 Effect of sturgeon bone collagen polypeptide on proliferation of cancer cells

2.6 鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響

抑制細(xì)胞增殖的途徑很多，其中凋亡是最常見，也是最主要的途徑，細(xì)胞凋亡分為早期凋亡、中期凋亡以及晚期凋亡，不同時(shí)期，蛋白酶表達(dá)不同。Slattery等[23]發(fā)現(xiàn)LL-37是通過激活caspase非依賴性的凋亡通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；化療藥物紫杉醇、阿霉素等都可通過激活caspase途徑誘導(dǎo)凋亡[24]。選擇抑制效果較好的1株癌細(xì)胞——人肺癌細(xì)胞A549，通過檢測(cè)處理前后，其各時(shí)期具有代表性的酶活力大小，進(jìn)而闡明作用機(jī)理。

2.6.1鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中caspase-1酶活力的影響

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是1個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族[25]。caspase 1是caspase家族中唯一可以剪切IL-1b前體蛋白或IL-18前體產(chǎn)生相應(yīng)成熟的細(xì)胞因子的酶，并可以產(chǎn)生20和10 ku的蛋白片段，這2個(gè)片段可以形成異源二聚體，并進(jìn)一步由2個(gè)異源二聚體形成四聚體，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著鱘魚骨膠原多肽濃度的增加，細(xì)胞中caspase-1酶活力增加，當(dāng)肽質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，酶活力可達(dá)216 IU/μg，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系(圖5)，表明骨膠原多肽處理細(xì)胞后，可以引起細(xì)胞早期凋亡。

圖5 鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中caspase-1酶活力的影響
Fig.5 Effect of sturgeon bone collagen polypeptide on caspase-1 enzyme activity in cancer cells

2.6.2鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中線粒體膜電位(JC-1)的影響

本試驗(yàn)采用熒光檢測(cè)酶標(biāo)儀對(duì)骨膠原多肽處理人肺癌細(xì)胞A549后的細(xì)胞線粒體膜電位電勢(shì)進(jìn)行了測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖6)，隨著處理濃度的增加，膜電位電勢(shì)Δψm呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度為 400 μg/mL 時(shí)，Δψm僅為239.875，低于陽性對(duì)照433.875。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。凋亡機(jī)制的深入研究表明，幾乎在所有誘導(dǎo)劑引起的各種類型的細(xì)胞凋亡中，如腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞凋亡等，均出現(xiàn)Δψm下降，并且由于膜電位電勢(shì)的改變可以引起膜通透性的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，Δψm下降為凋亡早期階段[26]。

圖6鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中線粒體膜電位(JC-1)的影響
Fig.6 Effect of sturgeon bone collagen polypeptide on mitochondrial membrane potential (JC-1) in cancer cells

2.6.3鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中caspase-3酶活力的影響

caspase-3(Cysteine-requiring Aspartate Protease 3)也稱凋亡執(zhí)行酶，最終可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，屬于細(xì)胞晚期凋亡酶[27-28]。Black等[29]在SD大鼠的IRI的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在凋亡心肌細(xì)胞中caspase-3酶活增加顯著，但僅為80.33%；Du等[30]在研究大豆異黃酮對(duì)2型糖尿病小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的抑制作用中發(fā)現(xiàn)，在高血糖環(huán)境下小鼠睪丸細(xì)胞凋亡增多，同時(shí)細(xì)胞中的caspase-3酶活力增強(qiáng)。本研究對(duì)鱘魚骨膠原多肽處理細(xì)胞后，細(xì)胞中的caspase-3酶活進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示隨多肽濃度的增加而增加，最大酶活可達(dá)149.90 IU/μg，顯著高于空白對(duì)照組(40.08 IU/μg)和陽性對(duì)照組5-FU(66.56 IU/μg)，說明鱘魚骨膠原多肽可以促進(jìn)凋亡酶活性的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞晚期凋亡的發(fā)生(圖7)。

3 討 論

圖7 鱘魚骨膠原多肽對(duì)癌細(xì)胞中caspase-3酶活力的影響
Fig.7 Effect of sturgeon bone collagen polypeptide on caspase-3 enzyme activity in cancer cells

癌癥是由于細(xì)胞中DNA突變，不能正常的調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，細(xì)胞異常分裂形成癌細(xì)胞。抑制癌細(xì)胞增殖是抗癌的主要途徑之一。關(guān)于食源性抗腫瘤蛋白酶解物和多肽的研究很多，如從鳳尾松分離的多肽Cr-ACP1[31]、分離自小牛脾臟的脾多肽[32]等都被證明具有很好的抗腫瘤效果，但其中來源是水產(chǎn)品的較少，Liang 等[33]考察海洋膠原肽對(duì)自然衰老過程中自發(fā)腫瘤的影響，發(fā)現(xiàn)攝入海洋膠原肽后雌雄SD大鼠自發(fā)腫瘤率有一定程度的下降，表明海洋膠原肽長(zhǎng)期喂養(yǎng)對(duì)SD大鼠自發(fā)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有一定的抑制作用，并在一定程度上可以延長(zhǎng)生存時(shí)間；Tao等[34]發(fā)現(xiàn)白僵菌素作為一種環(huán)肽，可降低線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活 caspase系統(tǒng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步的構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤肽限定為包含12～100個(gè)氨基酸殘基且富含堿性氨基酸(賴氨酸，精氨酸，組氨酸)的短肽。本研究利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)獲得了較高得率的鱘魚骨膠原多肽，肽含量為(72.36±2.33)%。生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示，鱘魚骨膠原多肽可以激活細(xì)胞中的凋亡蛋白酶caspase-1，形成細(xì)胞早期凋亡現(xiàn)象，進(jìn)而誘導(dǎo)PT孔打開，線粒體跨膜電位下降，激活凋亡執(zhí)行酶caspase-3，酶活性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。初步驗(yàn)證了鱘魚骨膠原多肽可以誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡，為鱘魚等水產(chǎn)品的精深加工及增值利用提供了新的思路與途徑。