馬鈴薯StTrxF基因的克隆與功能分析

陳新紅 葉玉秀 王永俊，2 陳許兵, 3 牛 遠(yuǎn) 周 青 王飛兵*

(1.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

馬鈴薯是繼水稻、玉米和小麥之后我國第四大糧食作物[1]，其面積和產(chǎn)量僅次于小麥、水稻和玉米[2]，屬弱耐鹽性作物，對水分虧缺和鹽非常敏感，鹽害不利于其生長，對產(chǎn)量影響極大，目前生產(chǎn)上廣泛種植的品種耐鹽性均不是很高[3]。我國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，鹽脅迫下作物吸水困難，使細(xì)胞組織的水分外滲，種子萌發(fā)和幼苗的生長受到抑制；由于作物體內(nèi)水分虧缺，進(jìn)而光合作用下降，能耗增加，衰老加速，生長量降低，甚至導(dǎo)致植株大面積死亡[4]。但是，由于馬鈴薯組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成熟、植株再生較容易，遺傳轉(zhuǎn)化的各種手段均可采用，又可以通過塊莖無性繁殖將轉(zhuǎn)基因的特性傳遞給后代而無需經(jīng)純化或多代選育[5]。所以，在全球干旱、鹽漬化環(huán)境嚴(yán)重以及我國“馬鈴薯主糧化”戰(zhàn)略背景[6]下，研究馬鈴薯相關(guān)基因?qū)}脅迫的耐受機(jī)制具有重要意義。

硫氧還蛋白Thioredoxin(Trx)是一類高度保守的低分子量蛋白質(zhì)[7]， 廣泛分布于植物、細(xì)菌、酵母和動物中。根據(jù)氨基酸序列的不同，Trx 分為家族Ⅰ和家族Ⅱ 2個家族[8]，Trx具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等功能，并且它與硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同構(gòu)成生物體內(nèi)重要的硫氧還蛋白系統(tǒng)，對維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)具有重要的作用[9]。硫氧還蛋白(Trx)還具有抗旱、耐熱、抗氧化脅迫和對抗逆基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的能力[10]，因此，設(shè)想可否將Trx通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆并導(dǎo)入到模式植物體中觀察其表現(xiàn)，驗(yàn)證其功能，進(jìn)而用以改良物種的遺傳性狀，這對提高植物耐鹽抗逆性將發(fā)揮積極作用。

隨著分子生物學(xué)理論研究的深入以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和產(chǎn)品的不斷升級換代，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，植物耐鹽性的研究取得很大的進(jìn)展和突破，將會有越來越多的耐鹽基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被揭示[11]。這對于耐鹽作物的培育、發(fā)展和土壤鹽堿地的科學(xué)防控治理將具有重大現(xiàn)實(shí)意義。通過對馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物耐鹽性及耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)之間關(guān)系的深入探索研究，可為耐鹽作物在生物基因工程方面的新探索與研究提供更多參考依據(jù)。

關(guān)于Trx蛋白調(diào)控植物耐鹽性的研究尚未見報道或鮮有報道。本研究旨在通過StTrxF基因的克隆與功能分析，以期揭示StTrxF基因的過表達(dá)在植物擬南芥中的耐鹽生理機(jī)制，同時為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物耐鹽能力方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯(Solanumtuberosum)品種中薯5號由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實(shí)踐教育中心實(shí)驗(yàn)室保存。

擬南芥(Arabidopsisthaliana)的種子經(jīng)過質(zhì)量濃度為2.5% CaClO2消毒后種植在黑土：蛭石：珍珠巖(體積比1∶1∶1)的混合基質(zhì)中，22 ℃， 16 h光照，8 h黑暗，冷光源培養(yǎng)2周。

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實(shí)踐教育中心實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體PMD-18T、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。

1.2 StTrxF基因的克隆及序列分析

取中薯5號無菌苗展開葉葉片約2.0 g，在液氮中研磨成粉狀，加入10 mL離心管中，用Applygen Technologies Inc，Beijing公司的植物RNA提取試劑盒提取總RNA，方法參照說明書。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN，GmbH，Germany)從總RNA中純化mRNA。純化所得mRNA符合試驗(yàn)要求，用于馬鈴薯StTrxF基因cDNA全長的克隆。

在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上選擇BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析StTrxF的全長cDNA序列。使用DNAMAN軟件對NCBI檢索的StTrxF和TrxF同源物的氨基酸序列進(jìn)行多重序列的比對分析。使用Prot-Param工具(http://Web.expasy.org/protparam/)計算理論相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)(pI)。使用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)軟件分析StTrxF的結(jié)構(gòu)域[12]。

1.3 StTrxF基因轉(zhuǎn)化擬南芥及檢測分析

植物表達(dá)載體構(gòu)建的方法參照Wang等[13-14]，用HindIII和EcoRI分別對質(zhì)粒pCAMBIA1301和質(zhì)粒pBI121雙酶切，將后者gusA編碼序列連同CaMV35S啟動子和NOS終止子片段反向插入pCAMBIA1301多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pCBGUS載體參照許紅梅等方法[15]，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得擬南芥擬轉(zhuǎn)基因植株。

用CTAB 法[16]提取轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的基因組DNA。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR 檢測，所使用的hptII基因引物為：hptII-F：5′-ACAGCGTCTCCG-ACCTGATGCA-3′和hptII-R：5′-AGTCAATGACC-GCTGTTATGCG-3′。在0.2 mL Eppendorf 離心管中加入10×PCR buffer 2 μL、dNTP(10 mol/L dNTP濃度是10 mmol/L)1 μL、引物(10 μmol/L)均為1 μL、 模板DNA(50 ng/μL) 2 μL、Taq DNA聚合酶 0.25 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃ 延伸2 min，共35個循環(huán)。

以表達(dá)StTrxF基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型植株為試驗(yàn)材料。使用Applygen植物RNA提取試劑盒(Tiangen Biotech, Beijing, China)提取這些植物葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiangen Biotech, Beijing, China)進(jìn)行第一鏈cDNA合成。利用Primer 5.0 設(shè)計基因特異性引物StTrxF-F：5′-GTCAGTGGTATGCGTTGCAG-3′和StTrxF-R：5′-CCTGTCCTACCGTCACAGTC-3′。內(nèi)標(biāo)基因選用擬南芥AtActin基因，AtActin-F：5′-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3和AtActin-R：5′-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3′。每個樣品均做4個平行管。PCR 熱循環(huán)儀為ABI 7500(Applied Biosystems)，操作軟件為7500 software V2.0.1，熒光染料為SYBR Green PCR Master Mix(Tiangen Biotech, Beijing, China)。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性鑒定

參照Wang等[13]的文獻(xiàn)，將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子，消毒滅菌后播種繼代培養(yǎng)于200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，脅迫培養(yǎng)2周后，觀察擬南芥植株的生長狀態(tài)和生根情況。

基于Wang等[17]的方法，將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，將植株移栽到盆中培養(yǎng)2周后，進(jìn)行鹽脅迫處理。用含有300 mmol/L NaCl的1/2 Hogland營養(yǎng)液每隔2 d灌溉1次，每次200 mL，處理4周，觀察植株生長情況。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的SOD/MDA/Pro的測定

鹽脅迫處理后，按試驗(yàn)方法稱取定量轉(zhuǎn)基因擬南芥的新鮮葉片對超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和脯氨酸(Pro)含量等生理指標(biāo)進(jìn)行測定。SOD活性的測定[18]。丙二醛含量的測定采用TBA比色法，參照李合生等[19]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的處理采用Excel軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；生物學(xué)信息分析采用DNAMAN軟件進(jìn)行分析。P<0.05 或P< 0.01被認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上有顯著或極顯著的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 StTrxF基因的克隆與序列分析

使用RT-PCR技術(shù)從馬鈴薯中克隆得到StTrxF基因：以馬鈴薯cDNA為模板，利用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到預(yù)期大小的片段(圖4)，將目的片段連接到PMD18-T載體后送樣測序，得到StTrxF基因的CDS序列。該基因開放閱讀框(ORF)549 bp，編碼182個氨基酸多肽，結(jié)果顯示其預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為44.17 ku和理論等電點(diǎn)(pI)為5.23。 利用InterProScan分析表明，StTrxF蛋白中含硫氧還蛋白F型結(jié)構(gòu)域。BLASTX檢索數(shù)據(jù)結(jié)果表明氨基酸StTrxF序列與SlTrxF1(番茄，Solanumlycopersicum，XP_004239649)，AtTrxF1(擬南芥，Arabidopsisthaliana， NP_186922.1)，CsTrxF1(亞麻薺，Camelinasativa，XP_010485595.1)，PeTrxF(山楊，Populuseuphratica，XP_011011425.1)，NaTrxF(煙草，Nicotianaattenuata，XP_019263-400)，BrTrxF(蕪青，Brassicarapa，XP_009118514.1)，AtTrxF2(擬南芥，Arabidopsisthaliana，NP_197144.1)，CaTrxF(辣椒Capsicumannuum，XP_016573859)，NsTrxF(煙草樟子松Nicotianasylvestris，XP_009784813.1)，EgTrxF1(赤霞珠，Erythrantheguttata，XP_012834827.1)，SiTrxF1(芝麻Sesamumindicum，XP_011077155.1)氨基酸同源性分別為96.02%，84.17%， 84.04%，83.26%，82.36%，82.11%，81.65%， 81.23%，79.06%，67.03%和59.28%(圖1)。進(jìn)化關(guān)系分析顯示，StTrxF與SlTrxF和CaTrxF的親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖1 StTrxF氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對Fig.1 StTrxF amino acid sequence and other species amino acid sequence comparison

方框標(biāo)注基因?yàn)樗芯磕繕?biāo)基因。The box labeled gene is the target gene of interest.圖2 StTrxF氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系樹Fig.2 StTrxF amino acid sequence and other species of amino acid sequence evolution relationship tree

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得

構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-StTrxF，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將StTrxF基因?qū)氲綌M南芥中，并通過Hgy抗性篩選獲得T3擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，命名為A1～A6。通過CTAB法提取T3擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA。PCR檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖3。從圖中可見，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-StTrxF的擬南芥擬轉(zhuǎn)基因植株和陽性對照擴(kuò)增出591 bp的目標(biāo)條帶，表明StTrxF基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中，并證明這些再生植株為轉(zhuǎn)基因植株；野生型擬南芥植株沒有擴(kuò)增出591 bp的目標(biāo)條帶。轉(zhuǎn)基因植株為后續(xù)功能分析。

M為Maker； W為陰性對照； P，質(zhì)粒pCAMBIA1301-StTrxF陽性對照； WT，野生型擬南芥，泳道A1～A6：pCAMBIA1301-StTrxF的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。下同。M， Maker； W, ddH2O； P，positive control；WT，wild type； A1-A6，transgenic Arabidopsis plants for transformation of pCAMBIA1301-StTrxF. The same below.圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的PCR分析Fig.3 PCR analysis of transgenic Arabidopsis plants

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明，StTrxF基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中得到不同程度的表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)基因植株中未表達(dá)，并且在轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)2和A3的表達(dá)量最高(圖4)。因此，選取轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)2和A3用于進(jìn)一步離體鑒定和盆栽鑒定。

* 和 ** 分別表示P<0.05和P<0.01水平的差異顯著。下同*and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的qRT-PCR分析Fig.4 Analysis of transgenic Arabidopsis plants by qRT-PCR

轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(A2和A3)的植株生長明顯優(yōu)于野生型擬南芥植株(WT)：轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片更大、顏色更綠，根長勢也更好，說明轉(zhuǎn)StTrxF基因植株的耐鹽性相較野生型有大幅度的提高(圖5 (a))。經(jīng)鹽脅迫處理4周后，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(A2和A3)的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型擬南芥植株(WT)，轉(zhuǎn)基因植株的存活率表現(xiàn)更好，野生型擬南芥植株褐化死亡。這表明StTrxF基因的過表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性(圖5 (b))。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株耐鹽生理指標(biāo)的測定

測定轉(zhuǎn)基因株系(A2和A3)和野生型植株(WT)于200 mmol/L NaCl鹽脅迫培養(yǎng)2周后，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株SOD活性和游離脯氨酸含量顯著高于野生型植株，而MDA含量顯著低于野生型植株(圖6)。這表明SOD活性增強(qiáng)、游離脯氨酸含量提高和MDA含量積累降低，植物耐鹽性增強(qiáng)；脯氨酸含量的增加，有利于維持細(xì)胞的滲透壓，同時，可保護(hù)酶和膜系統(tǒng)完整性免受毒害，從而緩解脅迫壓力，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株具有比野生型植株更加耐鹽(圖6)。

這些結(jié)果表明，過量表達(dá)StTrxF基因的擬南芥植株耐鹽性明顯增強(qiáng)，在鹽脅迫下StTrxF的過表達(dá)影響SOD活性、MDA和游離脯氨酸含量等耐鹽脅迫生理指標(biāo)合成，而StTrxF對其的調(diào)控機(jī)制存在差異，但相互之間存在關(guān)聯(lián)，綜上，馬鈴薯StTrxF基因在提升植物耐鹽性上具有重要調(diào)控作用。

正常條件為室溫25 ℃條件下不用NaCl處理。Normal conditions were not treated with NaCl at room temperature 25 ℃.圖5 轉(zhuǎn)StTrxF基因擬南芥植株耐鹽表型鑒定(a)，根長測定(b)和盆栽試驗(yàn)(c)Fig.5 Identification of salt tolerance phenotype of transgenic StTrxF gene Arabidopsis thaliana plant (a), root potted (b) and potted test (c)

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株SOD活性(a)， MDA(b)和脯氨酸含量(c)的測定Fig.6 Determination of transgenic Arabidopsis plant SOD activity (a)， MDA content (b) and proline content (c)

3 討 論

StTrxF基因廣泛存在于各類生物的細(xì)胞中，我們?yōu)楦由钊氲亓私庠摶虻墓δ?，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了功能分析。為驗(yàn)證馬鈴薯基因的功能，本研究以擬南芥作為首選轉(zhuǎn)化對象。通過鹽脅迫離體鑒定和盆栽鑒定，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)StTrxF基因擬南芥株系的耐鹽性較野生型植株強(qiáng)。從某種程度上，可解釋為StTrxF基因的過表達(dá)降低各類脅迫對植株造成的傷害，轉(zhuǎn)入的StTrxF基因激發(fā)擬南芥的抗逆信號途徑發(fā)生作用，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

越來越多的研究表明[20]，Trx可以通過多種途徑參與植物抗氧化脅迫：Trx是重要的氧化還原劑；Trx基因的表達(dá)常常與活性氧的增加有關(guān)。在植物的活性氧(ROS)清除酶系統(tǒng)中，SOD 作為ROS清除系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，迅速將過氧化物歧化為O2和H2O2，其活性的大小反映植物對逆境脅迫的適應(yīng)能力[21]。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時會啟動自身的防御酶系統(tǒng)以抵御逆境脅迫帶來的傷害[22]。以上這些研究為Trx基因在植物耐鹽改良上的應(yīng)用提供重要的理論參考。本試驗(yàn)對轉(zhuǎn)StTrxF基因擬南芥的研究表明，轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性都顯著高于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株具有更高的耐鹽能力。

Trx蛋白具有強(qiáng)的抗氧化作用，在較低量的條件下即可達(dá)到飽和狀態(tài)[23]。本試驗(yàn)對轉(zhuǎn)StTrxF基因擬南芥植株研究表明，野生型擬南芥植株的MDA含量較轉(zhuǎn)基因植株的含量更高，且轉(zhuǎn)基因植株具有較好的耐受能力。

游離脯氨酸的分配對植物的自我保護(hù)起著重要的作用，各組織中脯氨酸含量的多少，直接關(guān)系到其抗逆性的強(qiáng)弱[24]。本研究結(jié)果表明，在同一鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片的Pro含量顯著高于野生型植株，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性。

4 結(jié) 論

從馬鈴薯中成功分離并克隆StTrxF基因。StTrxF基因的過量表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫條件下的萌發(fā)率、植株存活率和根長都有增加，促進(jìn)植株的生長。本試驗(yàn)通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的離體鑒定、盆栽鑒定及SOD、MDA和脯氨酸等耐鹽生理指標(biāo)的測定，證實(shí)TrXF通過改變SOD和MDA等生理指標(biāo)能增強(qiáng)植物耐鹽性，在植物的抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。