miRNA-146a干預(yù)中晚期APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)影像對照研究

管修漢，陳雄金，陳曉東，羅澤斌，陳 琳，崔理立，趙 斌,3，麥 暉,3（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 .放射科；.神經(jīng)病學(xué)研究所；3.神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江 5400）

阿爾茨海默病(Altheimer’s Disease，AD)是一種起病隱匿、呈漸進性發(fā)展的神經(jīng)變性疾病，臨床上以認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)。其發(fā)生機制尚不明確，但Aβ級聯(lián)蛋白學(xué)說是AD諸多發(fā)病機制中較為公認(rèn)的一項學(xué)說，以β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為主要致病因素是AD發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此，對Aβ 環(huán)節(jié)的干預(yù)、減少Aβ的沉積以及由沉積而引致的神經(jīng)毒性損傷是治療AD的關(guān)鍵[1-2]。隨著精準(zhǔn)治療的提出，從基因水平對AD進行干預(yù)治療的研究越來越多[3]，相應(yīng)的對干預(yù)治療效果的判斷要求也越來越高，需要AD影像學(xué)結(jié)合行為學(xué)改變的特點以及病理學(xué)的變化以探討AD干預(yù)的療效。鐵代謝紊亂是AD 的特征表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)Aβ沉積內(nèi)鐵蛋白含量增高[4-5]。磁共振腦鐵成像技術(shù)能實現(xiàn)在活體中無創(chuàng)、可重復(fù)地評估AD患者腦內(nèi)鐵含量的改變[6]。Jack等[7-8]的研究表明中晚期APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠FSE序列行T2WI冠狀掃描表現(xiàn)為小鼠腦內(nèi)皮層及海馬區(qū)散在的點狀低信號影，且T2信號強度比值可以作為一個半定量指標(biāo)來評價腦內(nèi)病變的信號改變。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠因可在短期內(nèi)大量產(chǎn)生Aβ42及Aβ寡聚體，出現(xiàn)擬AD的病理改變，且隨著月齡增加這些病理改變會逐漸加重，成為目前AD研究的首選動物模型[9]。因此本研究分別選用了中期(12月齡)、晚期(18月齡)的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，給予miRNA-146a干預(yù)治療后，運用3.0T磁共振T2WI成像對海馬區(qū)與同側(cè)肌肉的T2信號強度比值進行測量，以期能半定量反映AD腦組織內(nèi)鐵代謝的改變，判斷APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的成模情況及其在miRNA-146a干預(yù)下的療效。

1 材料和方法

1.1 試劑

miR-146a agomir 和DEPC (Diethyl pyrocarbonate)為廣州艾基生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物

SPF(specific pathogen free)級12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠10只，18月齡8只，12月齡相同背景非轉(zhuǎn)基因野生型小鼠(C57BL/6型，簡稱C57小鼠)5只，18月齡4只，均為雄性，體質(zhì)量為24.0～43.4 g。試驗動物均由廣東省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級房，22～26 ℃，濕度為55%～65%，12 h光暗周期條件下飼養(yǎng)，自由獲取食物和水源。本實驗已通過廣東醫(yī)科大學(xué)倫理委員會倫理審核，及遵循相應(yīng)動物實驗操作規(guī)范。

1.3 動物分組

隨機將12月齡AD小鼠分為AD組和干預(yù)組，每組5只，12月齡C57小鼠5只作為正常組；隨機將18月齡AD小鼠分為AD組和干預(yù)組，每組4只，18月齡C57小鼠4只作為正常組。

1.4 實驗動物給藥

按照Hanson等[10]方法給予小鼠鼻腔滴注入。(1)將實驗劑量1 nmol miR-146a agomir溶于24 μL無酶的DEPC水中，冰盒中保存。(2) 在正式實驗前2周，用2.5 μL移液槍給小鼠以生理鹽水滴鼻使小鼠適應(yīng)。正式實驗時，干預(yù)組給予配好miR-146a agomir液體經(jīng)移液槍每次單鼻孔給予1 μL滴注，兩個鼻孔之間交替滴注，總量達(dá)8 μL后，給予小鼠休息5 min，使miR-146a agomir得到充分吸收，再進行下一個輪回，共3個輪回將24 μL滴注完。隔天干預(yù)1次，共15次。AD組和正常組小鼠均給予同等體積的載體DEPC水。

1.5 磁共振檢測

干預(yù)30 d后，次日所有實驗動物送至廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院磁共振室，腹部注射5%水合氯醛進行麻醉(麻醉量：體質(zhì)量×0.06 mL/g)后，裝入8通道橫向放置老鼠線圈然進行MRI檢查。

1.5.1 設(shè)備及成像參數(shù) 采用GE Signa Excite HD 3.0T超導(dǎo)磁共振系統(tǒng)，3.0T 8通道橫向放置老鼠線圈。主要掃描序列為冠狀T2WI和T1WI。FSE序列T2WI成像掃描參數(shù)：重復(fù)時間=3 000 ms，回波時間=68 ms，頻率=288，相位=288，激勵次數(shù)=6次，帶寬=31.25 kHz，回波鏈長度=12，層厚=0.8 mm，層間距=0.5 mm，頻率編碼視野=5.0 cm×5.0 cm，相位視野=0.70。FSE序列T1WI成像掃描參數(shù)：重復(fù)時間=480 ms，回波時間=最小值，頻率=320，相位=256，激勵次數(shù)=6次，帶寬=31.25 kHz，回波鏈長度=3，層厚=0.8 mm，層間距=0.5 mm，頻率編碼視野=5.0 cm×5.0 cm。掃描方法：先進行常規(guī)三平面定位掃描，然后進行小FOV三平面再一次定位掃描，在三平面點位圖像上進行常規(guī)冠狀T2WI及T1WI序列掃描。掃描范圍：平行雙側(cè)外耳道行小鼠全腦掃描。

1.5.2 圖像后處理及數(shù)據(jù)測量 掃描完成后將圖像傳至GE Medical Systems Functool 4.4工作站，在T2WI圖像上選取海馬和相同側(cè)的肌肉為感興趣區(qū)進行測量，測量時ROI大小均為1 mm2。數(shù)據(jù)測量采用盲法，在未知組別的情況下由1名影像醫(yī)師勾勒出相關(guān)感性趣區(qū)面積并進行測量和記錄數(shù)值。每間隔1個月再由同一醫(yī)師進行重復(fù)測量，共測量3次，取平均值作為T2WI信號強度比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

選用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析及LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)MRI成像

如圖1所示，與正常組比較，AD組小鼠顯示的海馬區(qū)散在點狀T2WI低信號影增多，經(jīng)miRNA-146a干預(yù)治療后(干預(yù)組)的小鼠海馬區(qū)T2WI信號較相同月齡AD組的小鼠強。

2.2 T2WI信號強度比值的比較

12和18月齡AD組小鼠的T2WI信號強度比值均比正常組降低(P<0.05或0.01)；干預(yù)組的T2WI信號強度比值則高于AD組(P<0.01)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.3 中晚期小鼠的肌肉信號分析

中晚期各組小鼠的肌肉信號相對穩(wěn)定，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表1 各組間T2WI信號強度比值的比較(±s)

表1 各組間T2WI信號強度比值的比較(±s)

AD組與同齡正常組比較：a P<0.05，bP<0.01；干預(yù)組與AD組比較：cP<0.01

images/BZ_23_1312_547_2241_618.png正常組2.26±0.29 2.95±0.11 AD組1.81±0.31a 12月齡18月齡12月齡18月齡12月齡18月齡5 4 5 4 5 4 2.09±0.14b干預(yù)組2.34±0.20c 2.65±0.04c

表2 小鼠肌肉T2WI信號值分析(±s)

表2 小鼠肌肉T2WI信號值分析(±s)

各組比較均P>0.05

images/BZ_23_1312_1236_2241_1307.png正常組2 882.40±576.91 2 854.25±206.85 3 739.00±746.27 3 418.25±655.45 3 231.40±704.00 2 664.00±135.19 AD組干預(yù)組12月齡18月齡12月齡18月齡12月齡18月齡5 4 5 4 5 4

3 討論

3.1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

圖1 干預(yù)后小鼠核磁共振檢測海馬區(qū)中Aβ沉積情況

目前認(rèn)為老年斑(SP)是AD的主要病理改變，而Aβ是SP的主要成分[11]，研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在腦內(nèi)沉積對神經(jīng)細(xì)胞的毒性是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素[12]。在與AD發(fā)病的相關(guān)基因內(nèi)，目前研究熱點主要包括位于21號染色體上的β淀粉樣前體蛋白(APP)基因和位于14號染色體上的早老素-1(PS-1)基因。轉(zhuǎn)基因模型小鼠是建立在基因遺傳基礎(chǔ)上，將外源性基因引入野生型小鼠內(nèi)，通過繁殖并基因遺傳，后代過多地表達(dá)該基因后而逐漸出現(xiàn)AD相關(guān)的病理學(xué)以及行為學(xué)改變。Janus等[13]報道單純PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠并沒有出現(xiàn)漸進性認(rèn)知障礙。由于AD是多基因參與的疾病，所以單一的轉(zhuǎn)基因小鼠模型不能完全模擬AD的病理生理特征。為了探討APP與PS-1基因間的相互關(guān)系，Gordon等[14]構(gòu)建了APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PS-1基因突變對突變型APP轉(zhuǎn)基因小鼠在Aβ的沉積上有增強作用。PS-1基因促進過多表達(dá)APP基因的小鼠腦內(nèi)大量Aβ42產(chǎn)生，使Aβ易于沉積在細(xì)胞外間質(zhì)的SP內(nèi)。這種模型能較好模擬Aβ發(fā)生過程，是目前常用的AD動物模型[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)AD患者的SP內(nèi)有高濃度鐵離子存在，免疫組織化學(xué)染色也證實在AD患者的SP內(nèi)有鐵沉積[5]。鐵離子等順磁性物質(zhì)在MRI的FSE序列T2WI下表現(xiàn)為點狀低信號改變，所以使用磁共振，特別是高場強磁共振能夠精確地探測腦內(nèi)鐵含量改變[6]。本實驗主要使用3.0T MRI的FSE序列行T2WI 冠狀掃描，表現(xiàn)為中晚期APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)皮層及海馬區(qū)散在的點狀低信號影，這與Jack等[7]的研究結(jié)果一致。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的影像學(xué)表現(xiàn)與AD的相符。

3.2 miRNA-146a的炎癥調(diào)節(jié)

miRNA通常被認(rèn)為是細(xì)胞命運的決定因素，并且越來越多地被認(rèn)為是各種腦部疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，從神經(jīng)發(fā)育障礙到腦腫瘤，再到神經(jīng)退行性疾病，使得miRNA成為治療神經(jīng)退行性疾病的一個非常有希望的靶點[15-16]。越來越多的研究[17]證明miRNA-146a參與調(diào)節(jié)人類神經(jīng)變性疾病的炎癥反應(yīng)，miRNA-146a作為先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在星狀膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。研究表明，miR-146a 的作用靶點包括補體因子H(CFH)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-1(IRAK-1)等，這些都與AD失調(diào)的先天免疫和炎癥通路有關(guān)[18]。Lukiw等[19]研究發(fā)現(xiàn)，利用NF-κB敏感性的pre-miRNA146a轉(zhuǎn)染星狀膠質(zhì)細(xì)胞，能上調(diào)miRNA146a的表達(dá)，同時下調(diào)CFH的表達(dá)，CFH作為免疫炎性反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可通過抑制旁路途徑(AP)而起到保護作用。miRNA-146a還可以作用于APP的金屬蛋白酶10(ADAM10)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子跨膜四旋TSPAN12，從而影響Aβ的代謝變化[20]。miRNA-146a的相關(guān)研究為臨床治療AD提供一定的理論基礎(chǔ)，但尚未通過相應(yīng)的臨床試驗證明，本研究從影像學(xué)角度證實了mRNA-146a干預(yù)后AD小鼠海馬區(qū)Aβ沉積有一定程度的減少。

3.3 T2信號強度比值

T2信號強度比值可以作為一個半定量指標(biāo)評價腦內(nèi)病變的信號改變[8]。本研究的T2WI信號強度比值采用的是相對的T2WI信號強度，即相同ROI下的海馬與同側(cè)肌肉的T2WI信號強度比值。AD的發(fā)生發(fā)展過程中，鐵等一些金屬離子起到一定的作用，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Jack等[7]的研究表明淀粉樣斑塊內(nèi)有鐵離子沉積。局部鐵含量可以影響MRI的弛豫時間，使得相對T2WI信號強度比值減低。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，AD組的T2WI信號強度比值降低，兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)，提示AD組小鼠海馬區(qū)鐵沉積較正常組增多。經(jīng)mRNA-146a干預(yù)治療后，對比AD組的T2WI信號強度比值有所增高，兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示干預(yù)組小鼠內(nèi)鐵沉積較AD組減少。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18月齡各組小鼠的T2WI信號強度比值比相對應(yīng)的12月齡各組小鼠高，這與傳統(tǒng)上認(rèn)為越到晚期AD小鼠海馬的鐵沉積越多T2WI信號強度比值應(yīng)該越低的觀點不一致[21]。導(dǎo)致本研究結(jié)果的原因，有可能是由于晚期AD小鼠海馬的膠質(zhì)細(xì)胞增生較早中期更明顯有關(guān)。有研究顯示MRI信號增高與膠質(zhì)細(xì)胞增生有關(guān)[22]。AD的主要病理改變是神經(jīng)元減少，老年斑形成，以及海馬神經(jīng)元顆粒空泡變性和膠質(zhì)細(xì)胞增生等，隨著時間增長，老年性小鼠腦部的空泡變性和膠質(zhì)細(xì)胞增生較早中期的小鼠明顯。另外亦有相關(guān)研究提示神經(jīng)細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致T2WI信號強度比值的增高[21]，這也有可能是導(dǎo)致本研究這一結(jié)果的原因之一。

3.4 本研究的局限性

本研究的樣本量偏少，結(jié)果的可靠性仍有待進一步證實。另本研究使用的臨床型GE MR750對小鼠頭部的SWAN和T2*掃描得到的圖像質(zhì)量不佳，可能與場強未能達(dá)到國外要求的7T或更高有關(guān)，且臨床使用的均為大孔徑磁共振，因此未能得到良好圖像以評估、量化AD小鼠腦部的鐵沉積狀態(tài)。

總之，運用3.0T磁共振T2WI成像對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬區(qū)的T2WI信號強度比值進行對比分析，有助于判斷APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的成模情況及其在miRNA-146a干預(yù)治療下的療效，為臨床AD患者的新型診療方案提供更多思路及理論支持。