羅非魚干擾素誘導(dǎo)蛋白35基因克隆及表達(dá)分析

黃 瑜，馬嘉霖，周棉鑫，陳敏琪，蔡 佳，簡紀(jì)常，湯菊芬

羅非魚干擾素誘導(dǎo)蛋白35基因克隆及表達(dá)分析

黃 瑜1,2,3，馬嘉霖1，周棉鑫1，陳敏琪1，蔡 佳1,2,3，簡紀(jì)常1,2,3，湯菊芬1,2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

【】研究尼羅羅非魚（）干擾素誘導(dǎo)蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）在免疫反應(yīng)中的作用。克隆獲得羅非魚基因開放閱讀框序列（GenBank登錄號：XM_003442606；），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測在健康羅非魚不同組織中的分布，以及不同刺激物刺激后的表達(dá)。基因編碼區(qū)為1 125 bp，編碼374個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為42.79 ku，等電點(diǎn)為5.01。含有1個(gè)LZD結(jié)構(gòu)域和2個(gè)Nmi/IFP 35 domain (NID)。多序列比對發(fā)現(xiàn)On-ifi35與其它物種的ifi35氨基酸序列同源性介于35.23% ~ 93.32%之間，且與斑馬擬麗魚同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，與斑馬擬麗魚的ifi35聚為一支。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，在健康羅非魚各組織中均有表達(dá)，其中在脾臟組織中表達(dá)量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎，在皮膚中表達(dá)量最低。經(jīng)無乳鏈球菌和PolyI:C刺激后，表達(dá)量在脾臟、腸道、體腎和頭腎中均發(fā)生顯著性變化且呈現(xiàn)出顯著的時(shí)序性。

尼羅羅非魚；；基因；克??；表達(dá)

干擾素（Interferon, IFN）是一類重要的α螺旋細(xì)胞因子，在脊椎動(dòng)物先天性免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要的功能[1-2]。根據(jù)IFN的基因序列與基因結(jié)構(gòu)，結(jié)合的受體和功能等方面，干擾素被分為I型（IFN-α和IFN-β）、I1型（IFN-γ）和III型（IFN-λs）。四足動(dòng)物中擁有3種類型的干擾素，而硬骨魚類僅具有I型和I1型IFN，缺少III型 IFN[3-5]。

干擾素主要通過改變特定基因的表達(dá)來影響細(xì)胞功能[6]。由干擾素誘導(dǎo)的干擾素誘導(dǎo)基因種類較多，如鳥苷酸結(jié)合蛋白、Mx、oligo（2-5A）合成酶、主要組織相容性復(fù)合物I類、II類和I11類基因、與血小板因子4相關(guān)的多肽家族、角蛋白K17、參與抗原呈遞的蛋白質(zhì)、吲哚胺2,3-雙加氧酶和IFP 53/trypto-phanyl-tRNA合成酶等[7-8]。干擾素誘導(dǎo)蛋白35（interferon induced protein 35，ifi35）屬于干擾素誘導(dǎo)蛋白的一種，哺乳動(dòng)物人ifi35作為1.4 kb的單一mRNA種類存在，其中亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（leucine zipper domains，LZD）可促使基本區(qū)亮氨酸拉鏈（Basic region leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子二聚化，形成1個(gè)鄰近富含堿性氨基酸的雙邊DNA結(jié)合區(qū)[9]。ifi35另外2個(gè)相同的NMI/IFP 35結(jié)構(gòu)域（NID）串聯(lián)重復(fù)，介導(dǎo)NMI-NMI蛋白質(zhì)相互作用和亞細(xì)胞定位[10]。目前ifi35的功能研究主要集中在哺乳動(dòng)物當(dāng)中，低等脊椎動(dòng)物、魚類ifi35的研究還非常欠缺。

尼羅羅非魚（）作為聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的世界性養(yǎng)殖品種，近年來養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到各種病原菌威脅，如細(xì)菌、寄生蟲、病毒等，尤其是近年來在全世界爆發(fā)的羅非魚羅湖病毒，給行業(yè)造成巨大損失[11-14]。因此，研究羅非魚機(jī)體抗病毒機(jī)制，對于將來羅非魚疾病防治具有重要作用。本研究通過克隆獲取羅非魚基因全長，對在健康羅非魚各組織的分布進(jìn)行研究，對不同刺激物刺激后的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果為進(jìn)一步探究參與的機(jī)體免疫反應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用健康尼羅羅非魚購自高州市朗業(yè)養(yǎng)殖場，體質(zhì)量約為50 g/尾。無乳鏈球菌（ZQ0910）菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。PolyI:C購自Sigma公司；克隆載體pMD18-T Vector、rTaq、Premix Taq購自TaKaRa公司(大連)；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、RNA提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和qPCR試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收純化試劑盒購自Thermo Fisher公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA的提取和cDNA的合成 羅非魚在實(shí)驗(yàn)室條件下(28 ± 2) ℃暫養(yǎng)1周后，無菌條件下取皮膚、頭腎、鰓、腦、體腎、腸、肌肉、心臟、肝、胸腺和脾11個(gè)組織，各取羅非魚3尾，每尾魚作為1個(gè)平行，放入2 mL凍存管中，液氮速凍后–80 ℃保存，用于基因克隆和用于不同組織表達(dá)分析。

對于刺激實(shí)驗(yàn)設(shè)置取樣。無乳鏈球菌刺激組：腹腔注射濃度為1×107cfu/mL的無乳鏈球菌0.1 mL；polyI:C刺激組：腹腔注射濃度為100 μg/mL的polyI:C 0.1 mL；對照組：腹腔注射0.1 mL的磷酸緩沖液（PBS），分別在 0、3、6、12、24、48、72、96 h各取羅非魚3尾，每尾魚作為1個(gè)平行，取脾臟、體腎、頭腎和腸道組織，放入 2 mL凍存管中，液氮中保存。根據(jù) TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚各組織RNA。按照北京全式金公司的 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix 說明書將提取到的羅非魚各樣本的總 RNA反轉(zhuǎn)成 cDNA。

1.2.2 羅非魚基因的克隆 依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室羅非魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合NCBI上公布的羅非魚基因組數(shù)據(jù)預(yù)測的基因序列，利用Primer 6.0設(shè)計(jì)On-ifi35基因引物（On-ifi35-1F：ATGATGCGCCTTTGTGTTTTTC）、（On-ifi35-1125R：TCACACTTTTCTGCTCTTTACTCTAGA），以1.2.1制備的羅非魚脾臟cDNA為模板，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，On-ifi35-1F 1 μL，On-ifi35-1026R 1 μL。PCR 反應(yīng)條件設(shè)置為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后對其進(jìn)行切膠回收，目的條帶與pMD 18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后離心濃縮細(xì)菌培養(yǎng)液至100 μL培養(yǎng)基中，將其均勻涂布于含100 ng/μL濃度Amp+的LB瓊脂糖固體平板上，倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 ~10 h，挑選單菌落于含 Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)3 ~ 5 h，用pMD 18-T載體上的通用引物（M13：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；RV：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA）進(jìn)行菌落 PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物公司測序。

1.2.3基因的生物信息學(xué)分析 對克隆獲得的cDNA序列使用NCBI (https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對分析；利用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行On-ifi35氨基酸序列推導(dǎo)和相關(guān)理化性質(zhì)分析；通過TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs. dtu. dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；通過Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART(http:// smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析；通過Clutalx和Genedoc軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對分析。通過MEGA6.0 軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 qRT-PCR檢測的表達(dá) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)參考本實(shí)驗(yàn)室方法[15]。首先利用的特異性引物（On-ifi35-qF：TAACGGAAGAAAGGTGGC）、（On-ifi35-qR：GTGTTCCAGGTGGTATCG）。以為內(nèi)參基因（β-actin-F: AACAACCACACACCACACATTTC，β-actin-R:TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTT），使用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀檢測在各個(gè)組織以及不同刺激后的表達(dá)分析。qPCR 參照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用 2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量。此外，在羅非魚各組織中分布的檢測中，把皮膚組織表達(dá)量作為1，各個(gè)組織的相對表達(dá)量=每個(gè)組織的表達(dá)量/皮膚組織的表達(dá)量。在刺激組中，各組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量=實(shí)驗(yàn)組各組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量/對照組織相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 On-ifi35的序列特征

克隆獲得的（GenBank 登錄號: MF975639）基因全長為1 125 bp，可編碼374個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子質(zhì)量為42.79 ku，等電點(diǎn)為5.01。將On-ifi35基因與NCBI上基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，On-ifi35基因組位于羅非魚的第四號染色體上，由 10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=protein_gene&from_uid=348510241）。序列分析表明，On- ifi35 含有1個(gè)LZD結(jié)構(gòu)域（19-36-43-53-66 aa）和2個(gè)NID結(jié)構(gòu)域（162-249aa，261-347aa）（圖 1）。利用ClustalW2 軟件，將On-ifi35氨基酸序列與其它物種的ifi35氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)On-ifi35與其它物種的相似性在35.23% ~ 93.32%之間（圖 2），其中On-ifi35與同是鱸形目慈鯛科的淡水魚類斑馬擬麗魚同源性較高，而與高等哺乳動(dòng)物鼠的ifi35同源性較低。利用 Mega 6.0軟件的 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示哺乳動(dòng)物與魚類的ifi35聚為2個(gè)不同的分支，且羅非魚的ifi35與斑馬擬麗魚的ifi35聚為1支，具有最近的親緣關(guān)系（圖 3）。

下劃線表示LZD結(jié)構(gòu)域（19-36-43-53-66 aa），灰色背景表示Nmi/IFP 35 結(jié)構(gòu)域 (NID)（162-249 aa，261-347 aa）

GenBank 登錄號 (accession numbers): O.niloticus XP_003442654.1; M.zebra XP_004552562.1; M.albus XP_020461212.1; O.latipes XP_023813097.1; L.crocea XP_010744566.3; O.mykiss XP_021414073.1; S.salar NP_001135293.1; H.sapiens XP_016880073.1; M.musculus NP_081596.1

圖3 鄰位相連法構(gòu)建ifi35氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 On-ifi35在羅非魚各組織中的分布

的各組織表達(dá)檢測結(jié)果（圖4）顯示，在健康羅非魚的11個(gè)組織中均能表達(dá)，且在脾臟組織中表達(dá)量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎、在皮膚中表達(dá)量最低。

SK：皮膚；HK：頭腎；G：鰓；B：腦；K：體腎；I：腸；M：肌肉；H：心臟；L：肝；T：胸腺；S：脾；On-ifi35在皮膚中的表達(dá)量設(shè)為1。

2.5 無乳鏈球菌刺激后On-ifi35在羅非魚各組織中的表達(dá)

無乳鏈球菌刺激羅非魚后，用qRT-PCR檢測在脾臟、腸道、體腎和頭腎等4個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)。結(jié)果如圖5顯示，在脾臟組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再降低，最后恢復(fù)到正常水平的變化，其中3 h顯著性增加(< 0.05)，而在24 h顯著性降低(< 0.05)；在腸道和頭腎組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再降低的變化，其中在腸道組織中，3 h極顯著增加(< 0.01)，12h顯著性增加(< 0.05)；在頭腎組織中，3 h和6 h均顯著性增加(< 0.05)；在體腎組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低再升高的變化，其中，6 h、12 h和24 h均極顯著降低< 0.05)。

2.6 PolyI:C刺激后On-ifi35在羅非魚各組織中的表達(dá)

同樣的，PolyI:C刺激羅非魚后，用qRT-PCR檢測在脾臟、腸道、體腎、頭腎四個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)，結(jié)果如圖6顯示，的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高再降低，最后恢復(fù)到正常水平的變化，其中在脾臟組織3 h顯著性增加(<0.05)，在腸道和頭腎組織中，3 h和6 h都發(fā)生了極顯著增加(<0.01)，在體腎組織中，3 h極顯著增加(<0.05)。

*: 差異顯著(< 0.05); **: 差異極顯著(< 0.01)；在各個(gè)對照中的表達(dá)量均設(shè)為1

*: Significant difference (< 0.05); **: Very significant difference (< 0.01); Expression level of On-ifi35 in each control was set as 1

圖5 無乳鏈球菌刺激后在不同組織的時(shí)序表達(dá)

Fig. 5 Expression analysis ofin different tissues after stimulated by

*: 差異顯著(P < 0.05); **: 差異極顯著(P < 0.01)；On-ifi35在各個(gè)對照中的表達(dá)量均設(shè)為1

3 討論

本研究首先克隆獲得的基因全長為1 125 bp，編碼 374 個(gè)氨基酸，通過與NCBI上公布的基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，位于羅非魚的第四號染色體上，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成。且與高等哺乳動(dòng)物人類ifi35相同，整個(gè)基因組中只有一個(gè)單拷貝[9]，暗示其功能在進(jìn)化過程中未發(fā)生較大的擴(kuò)張。序列分析表明，On-ifi35含有1個(gè)LZD結(jié)構(gòu)域（19-36-43-53-66 aa）和2個(gè)NID結(jié)構(gòu)域（162-249 aa，261-347 aa）。哺乳動(dòng)物中，LZD結(jié)構(gòu)域可促使bZIP轉(zhuǎn)錄因子二聚化，形成一個(gè)鄰近富含堿性氨基酸的雙邊DNA結(jié)合區(qū)。NID大約由90 ~ 92個(gè)氨基酸構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域在每個(gè)蛋白質(zhì)中串聯(lián)重復(fù)，并介導(dǎo)NMI-NMI蛋白質(zhì)相互作用和亞細(xì)胞定位[10]。羅非魚ifi35同樣具有保守的NID和LZD結(jié)構(gòu)域，暗示ifi35從高等哺乳動(dòng)物到低等脊椎動(dòng)物魚類的功能具有相似性。多序列比對顯示，On-ifi35與同是鱸形目慈鯛科的淡水魚類斑馬擬麗魚具有93.32 %的同源性，而與哺乳動(dòng)物人和鼠同源性相對較低，但是重要結(jié)構(gòu)域比較保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，羅非魚的ifi35與斑馬擬麗魚的ifi35聚為1支，具有最近的親緣關(guān)系（圖 3）。綜上所述，本研究所獲得的羅非魚ifi35是ifi35家族的一員。

人在不同細(xì)胞群如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中均可表達(dá)。ifi35的同源物NMI，在許多被檢測的細(xì)胞系中（來源于肝、腎、T細(xì)胞、B細(xì)胞、前列腺、子宮和宮頸的腫瘤）均可表達(dá)，且NMI蛋白的最高水平在胸腺、脾臟和肝臟[16]。目前在魚類當(dāng)中還未有表達(dá)的分析。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，在健康羅非魚各組織中均有表達(dá)，其中在脾臟組織中表達(dá)量最高，其次是胸腺、肝臟、心臟、肌肉、腸道、體腎、腦、鰓、頭腎，在皮膚中表達(dá)量最低。脾臟、胸腺組織作為羅非魚重要的免疫器官，還有大量T細(xì)胞和B細(xì)胞，與哺乳動(dòng)物的同源物NMI的分布類似。PolyI:C作為病毒類似物刺激魚體后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生抗病毒的免疫反應(yīng)[17]。而ifi35作為調(diào)節(jié)干擾素表達(dá)的關(guān)鍵分子，在機(jī)體應(yīng)答外源物刺激后的表達(dá)特點(diǎn)還未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無乳鏈球菌和PolyI:C刺激后，的表達(dá)量在羅非魚的脾臟、腸道、體腎和頭腎中均發(fā)生顯著性變化且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)序性，此結(jié)果表明，在魚體抵抗細(xì)菌和病毒感染過程中均可發(fā)揮一定作用。然而體腎組織作為魚體的重要排泄器官，2種刺激物刺激后的表達(dá)模式呈現(xiàn)相反的時(shí)序依賴性，推測可能由于機(jī)體應(yīng)對2種不同外源物質(zhì)產(chǎn)生了不同的應(yīng)答機(jī)制，但是具體原因需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得基因全長序列，通過結(jié)構(gòu)域分析、序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，所獲基因是ifi35家族成員。在健康羅非魚各組織中均有表達(dá)，無乳鏈球菌和PolyI:C刺激羅非魚后，在脾臟、腸道、體腎和頭腎等4個(gè)組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著性變化。

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Cloning and Expression Analysis ofin Nile Tilapia ()

HUANG Yu1,2,3, MA Jia-lin1, ZHOU Mian-xin1, CHEN Min-qi1, CAI Jia1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, TANG Ju-fen1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

To investigate the role of interferon induced protein 35 (ifi 35) in the immune response of.The open reading frame of tilapiagene (GenBank accession number: XM_003442606;) was cloned and the distribution ofin different tissues of healthy tilapia and stimulation with different stimuli was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.gene is 1125 bp, encoding 374 amino acids, the theoretical molecular mass is 42.79 ku, and the isoelectric point is 5.01. On-ifi 35 contains one LZD domain and two Nmi/IFP 35 domain (NID). Multiple sequence alignment revealed that On-ifi 35 shared 35.2% - 93.3% sequence homology with ifi 35 from other species, and had the highest homology with. Phylogenetic analysis results indicate that On-ifi 35 was clustered with ifi 35 of the. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all tissues of healthy tilapia. The highest expression was found in the spleen, followed by thymus, liver, heart, muscle, intestine, body kidney, brain, gill and head kidney. The lowest expression level was in the skin. After stimulation withagalactiae and PolyI:C, the expression level ofwas significantly changed in the spleen, intestine, mid-kidney and head kidney.

;; gene; cloning; expression

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）02-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.003

2019-08-15

國家自然科學(xué)基金(31572651)；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目(230419083)

黃瑜（1986－），男，講師，博士，研究方向?yàn)轸~類免疫學(xué)。 E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

湯菊芬（1964－），女，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail：tjf10002000@163.com

黃瑜，馬嘉霖，周棉鑫，等. 羅非魚干擾素誘導(dǎo)蛋白35基因克隆及表達(dá)分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（2）：13-19.

（責(zé)任編輯：劉嶺）