魚腥草多糖的制備及其體外抗病毒活性研究

劉苗苗，崔清華，范路路，李忠原，田景振

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)原產(chǎn)于東南部和東南部東北亞國(guó)家開花植物，為三白草科植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分。魚腥草在我國(guó)醫(yī)學(xué)體系中有著悠久的應(yīng)用歷史，有清熱解毒的功效，可治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱淋、熱痢、癰腫瘡毒等癥[1]。

現(xiàn)代研究表明，魚腥草具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、解熱、陣痛、抑制血小板聚集等作用[2-5]。在抗病毒方面，魚腥草對(duì)于多種病毒(如HSV-1、HIV、H1N1等)[6,7]均有很好的抑制效果，并且在已經(jīng)應(yīng)用于臨床的抗病毒藥物(如蓮花清瘟膠囊、四季抗病毒合劑、魚腥草抗病毒合劑等)的組方中均可見魚腥草。

據(jù)報(bào)道，魚腥草水提取物能夠抑制單純皰疹病毒1型(HSV)，甲型流感病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)[6]和重癥病毒急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)[8]等病毒的活性。在魚腥草水提物的活性成分中，蘆丁、金絲桃苷、綠原酸等[8]都被證明有著不同程度的抗病毒效果。在水提物中，多糖占據(jù)著很大的比例，而天然藥物中所含的多糖類成分通常有著很好的抗病毒作用，如金銀花多糖[9]、香菇多糖[10]、黃芪多糖[11]等。目前魚腥草多糖已經(jīng)被證實(shí)有著多種藥理活性，包括抗氧化[2]、抗補(bǔ)體活性[12]、抑菌[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]以及抑制癌細(xì)胞[15]等作用，此外，魚腥草多糖還能夠有效地改善由流感病毒引起的肺炎以及腸道損傷[16]，同時(shí)，魚腥草多糖對(duì)小鼠諾如病毒也顯示出了良好的抑制能力[17]。然而，魚腥草多糖是否對(duì)病毒本身有著直接的抑制作用卻很少有人研究。我們?cè)谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水提醇沉法處理魚腥草所得沉淀物抗病毒活性高于水提物，而沉淀物中以多糖類成分為主。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外抗病毒為指標(biāo)，提高魚腥草多糖純度，以期為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及主要試劑

魚腥草飲片，購買于安國(guó)市祁澳中藥飲片有限公司(產(chǎn)地：湖南，批號(hào)：1805368121)；利巴韋林注射液(rebavinrin injection，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1511196821)；Sevage試劑(氯仿:正丁醇 = 5:1)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：20220110)；1640培養(yǎng)基(HyClone公司，產(chǎn)品批號(hào)：AAJ207653)；青鏈霉素混合液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：15140-122)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Gibco公司Lot：8118102)；胰酶消化液(0.25%Trypsin-EDTA，美國(guó)Gibco公司，Lot：1859509)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：520C0322)；噻唑藍(lán)染液(MTT，百賽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1636c097)。

1.2 宿主細(xì)胞及病毒毒種

人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)、人喉癌上皮細(xì)胞(Hep2細(xì)胞)購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；柯薩奇病毒B3(Coxsakievirus B3，CV-B3)、腸道病毒71型(Human Enterovirus 71,EV71)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 儀器

MK3酶標(biāo)儀(labsystems)；電熱恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HFsafe-1200TE)；全自動(dòng)高壓滅菌鍋(YMS-280B型，寧波鎮(zhèn)海金鑫)；TDD5M臺(tái)式平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF90)；冷凍干燥機(jī)(德國(guó) Christ公司，ALPHA 1-4 LD plus)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 魚腥草水提物的制備

取干燥魚腥草藥材，粉碎，過40目篩。稱取魚腥草粉末200 g置于圓底燒瓶，加入10倍量蒸餾水，加熱回流提取，重復(fù)提取3次，每次2 h。藥液過濾，離心(3 000 rpm，5 min)，取離心所得上清液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮(70 ℃，-0.085 MPa)至1 g/mL(原藥材比例)，得魚腥草水提濃縮液。取濃縮液400 mL，-20 ℃預(yù)凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得到水提物(S1)。其余備用，制備魚腥草多糖。

2.2 魚腥草多糖的不同制備工藝

2.2.1 酶法除蛋白

取2.1項(xiàng)下魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調(diào)至pH = 2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴10 h，離心(3 000 rpm，5 min)，抽濾，取濾液；加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，抽濾，取濾液；放置至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預(yù)凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12h，得到干燥產(chǎn)物(S2)，計(jì)算得率，同法重復(fù)三次。

2.2.2 酶法-Sevag(pH = 7)法除蛋白

取濃縮魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調(diào)pH至2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴5 h，離心(3 000 rpm，5 min)，上清液抽濾，取濾液，NaoH溶液調(diào)至pH = 7，分5次加入Sevag試劑(每次加入量為藥液的1/5)，每次加完后離心取上清液再次加入Sevag試劑。第五次上清液加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，放冷至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預(yù)凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得干燥產(chǎn)物(S3)，重復(fù)三次。

2.2.3 酶法-Sevag(pH = 4)法除蛋白

取濃縮魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調(diào)至pH = 2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴5 h，離心(3 000 rpm，5 min)，抽濾，NaOH調(diào)至pH = 4，分5次加入Sevag試劑(每次加入量為藥液的1/5)，每次加完后離心取上清液再次加入Sevag試劑。第五次上清液加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，放冷至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預(yù)凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得干燥產(chǎn)物(S4)，重復(fù)三次。

2.3 魚腥草多糖含量的測(cè)定(苯酚-濃硫酸法)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取分析純無水葡萄糖適量，干燥至恒重。精密稱取干燥的葡萄糖60 mg，置于100 mL容量瓶，加水定容，超聲混勻，得葡萄糖對(duì)照品溶液。用移液槍取葡萄糖對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于50 mL的容量瓶中，加水定容并超聲混勻，得對(duì)照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5，備用。取對(duì)照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5各2 mL于試管中，各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL，搖勻。40 ℃水浴30 min，取出再冰水浴5 min。

以蒸餾水調(diào)零并于490 nm處測(cè)定吸光度值，每組平行測(cè)定三次，取均值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 多糖含量的測(cè)定

分別稱取S1、S2、S3、S4粉末適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加水定容得樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4。取樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4各2 mL于試管中，各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL，搖勻。40 ℃水浴30 min，取出再冰水浴5 min。

以蒸餾水調(diào)零并于490 nm處測(cè)定吸光度值，每組平行測(cè)定三次，取均值。代入得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算相應(yīng)的濃度，以及各干燥產(chǎn)物的多糖含量。

2.4 魚腥草抗病毒活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 不同供試液的制備

分別稱取適量S1、S2、S3、S4、2% DMSO的細(xì)胞維持液配制為20 mg/mL的溶液，渦旋、超聲10 min以充分溶解。0.22 μm微孔濾膜除菌過濾，分裝至1 mL無菌EP管中，即得Y1、Y2、Y3、Y4。

2.4.2 陽性對(duì)照藥的制備

利巴韋林注射液采用原液，濃度為50 mg/mL。

2.4.3 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

-80 ℃冰箱中取出保存有宿主細(xì)胞的凍存管，室溫融化。超凈工作臺(tái)內(nèi)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，離心(800 rpm，5 min)，棄去上清液，加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(10%FBS)，吹打細(xì)胞，吸取新得到的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度75%)中培養(yǎng)即可。

2.4.4 病毒的擴(kuò)增

將0.5 mL病毒液接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的宿主細(xì)胞上，置37 ℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照，加入0.5 mL細(xì)胞維持液(2%FBS)，同法培養(yǎng)1 h后，將病毒瓶和對(duì)照瓶加入4.5 mL細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待90%的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，反復(fù)凍融3～4次，離心(1 000 rpm，5 min)，取上清液定量分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.5 病毒毒力的測(cè)定

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的宿主細(xì)胞，將其消化并稀釋濃度為 1×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待其長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，棄掉培養(yǎng)液。以10倍比稀釋待測(cè)病毒液，共稀釋10個(gè)濃度梯度，依次加入到長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的96孔板中，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔。置37 ℃、5% CO2培箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察，至90%的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)停止培養(yǎng)。每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL染色，于病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h，吸棄染液，加入100 μL DMSO，室溫脫色10 min，用MK3酶標(biāo)儀(labsystems)測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD值)，并計(jì)算病毒液的半數(shù)感染濃度(TCID50)。

細(xì)胞存活率 = 各組OD值/

正常細(xì)胞OD值×100%

細(xì)胞比距 = (高于50%病變率-50%)/

(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病

毒稀釋度+比距×稀釋因子對(duì)數(shù))

2.4.6 藥物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的宿主細(xì)胞，消化并稀釋濃度至1×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待其長(zhǎng)成單層細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液。魚腥草水提液用細(xì)胞維持液按2倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，依次接種于長(zhǎng)滿宿主細(xì)胞的96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔、空白對(duì)照孔及細(xì)胞對(duì)照孔，于病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變情況。

2.4.7 抗病毒活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)

分別將供試液Y1、Y2、Y3、Y4和利巴韋林陽性藥二倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，取100 μL藥液與等體積100倍TCID50濃度的病毒液相互作用2 h后，接種于單層宿主細(xì)胞上，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)為各藥物組和利巴韋林陽性對(duì)照組；加入100 μL維持液和100 μL病毒液設(shè)為病毒對(duì)照組；加入200 μL維持液設(shè)為細(xì)胞對(duì)照組；加入100 μL藥液和100 μL病毒液，另設(shè)為無細(xì)胞的空白對(duì)照組。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待病毒對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)90%及以上病變時(shí)停止培養(yǎng)，采用CPE法記錄藥物抑毒情況，并用MTT 法測(cè)定每孔在490 nm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，應(yīng)用Reed-Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度EC50及治療指數(shù)(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50=[Antilog(高于50%CPE百

分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(shù)(TI)=半數(shù)毒性濃度(TC50)/

半數(shù)有效濃度(EC50)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 魚腥草提取結(jié)果

表1 魚腥草不同干燥產(chǎn)物得率

對(duì)魚腥草不同干燥產(chǎn)物的質(zhì)量與得率進(jìn)行了測(cè)定：水提物取400 mL濃縮液直接凍干獲得7.487 8 g凍干粉S1，得率為1.87%；其余三種酶處理水提液各取200 mL濃縮液進(jìn)行處理并凍干，分別獲得凍干粉S2為2.027 0 g、S3為1.663 0 g、S4為1.754 6 g，得率分別是1.01%、0.83%、0.88%。

3.2 魚腥草水提物不同處理方法產(chǎn)物多糖含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

依據(jù)2.3.1中的方法，計(jì)算對(duì)照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5葡萄糖溶液的濃度，并測(cè)量各自的吸光度，以對(duì)照品梯度溶液的葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：A =

13.889C+0.062 5(A-吸光度；C-葡萄糖濃度)；R2為0.999 1。所得回歸曲線：

圖1 葡糖糖濃度曲線Fig.1 Glucose concentration curve

3.2.2 魚腥草水提物不同處理方法產(chǎn)物多糖純度

對(duì)樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4進(jìn)行吸光度測(cè)定并計(jì)算其多糖的濃度與純度，結(jié)果如下表。

表2 不同樣品的多糖濃度

表3 三種病毒的TCID50

注：表()內(nèi)為病毒各自的宿主細(xì)胞。

Note:Table () is the host cell of each virus.

結(jié)果如表2所示，S3的多糖純度最高。多糖純度由高到低為S3>S4>S2>S1。

3.3 病毒毒力測(cè)定結(jié)果

按照上文2.4.5測(cè)定EV71、RSV以及CV-B3這三種病毒的病毒毒力以半數(shù)感染濃度TCID50來表示，分別如上表所示。其中EV71病毒的宿主細(xì)胞是RD細(xì)胞，而RSV和CV-B3病毒的宿主細(xì)胞是Hep2細(xì)胞。

3.4 魚腥草水提取物及3種多糖的體外抗病毒結(jié)果

魚腥草水提物不同處理方法所得四種樣品對(duì)于這三種病毒則均顯示出一定的抑制作用。

不同形態(tài)細(xì)胞見圖2、圖3、圖4；抗病毒結(jié)果見表4。

圖2 魚腥草多糖體外抗EV71結(jié)果Fig.2 Anti-EV71 results of houttuynia cordata polysaccharide in vitro注：A.正常RD細(xì)胞；B.EV71病毒感染對(duì)照組細(xì)胞；C.陽性藥利巴韋林對(duì)照組；D.魚腥草有效對(duì)照組(魚腥草水提物)。Note:A.Normal RD cells;B.Cells infected with EV71 virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (water extract).

EV71的宿主細(xì)胞 RD細(xì)胞在正常狀態(tài)下呈現(xiàn)飽滿的梭形狀態(tài)，在感染病毒后出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡現(xiàn)象；在藥物毒性實(shí)驗(yàn)組中，由于藥物自身毒性也使得RD細(xì)胞出現(xiàn)死亡的狀況；經(jīng)過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒RD細(xì)胞存活率與細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

圖3 魚腥草多糖體外抗RSV結(jié)果Fig.3 Anti-RSV results of Houttuynia cordata polysaccharide in vitro注：A.正常Hep2細(xì)胞；B.RSV病毒感染對(duì)照組細(xì)胞；C.陽性藥利巴韋林對(duì)照組；D.魚腥草有效對(duì)照組(酶法-Sevage pH = 7)。Note:A.Normal Hep2 cells;B.Cells infected with RSV virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (Enzyme treatment Sevag pH = 7).

RSV病毒的宿主細(xì)胞Hep2細(xì)胞正常狀態(tài)呈現(xiàn)飽滿的多邊狀態(tài)，感染病毒后出現(xiàn)大量的細(xì)胞破裂、死亡；經(jīng)過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒Hep2細(xì)胞存活率與細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

CV-B3病毒的宿主細(xì)胞Hep2細(xì)胞正常狀態(tài)呈現(xiàn)飽滿的多邊狀態(tài)，感染病毒后出現(xiàn)大量的細(xì)胞破裂、死亡；經(jīng)過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒Hep2細(xì)胞存活率與細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，且最優(yōu)的魚腥草水提物組對(duì)于病毒的抑制作用較利巴韋林的抑制作用差異較小。

圖4 魚腥草多糖體外抗CV-B3結(jié)果Fig.4 Anti-CV-B3 results of houttuynia cordata polysaccharide in vitro.注：A.正常Hep2細(xì)胞；B.CV-B3病毒感染對(duì)照組細(xì)胞；C.陽性藥利巴韋林對(duì)照組；D.魚腥草有效對(duì)照組(酶法-Sevage pH = 7)。Note:A.Normal Hep2 cells;B.Cells infected with CV-B3 virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (Enzyme treatment Sevag pH = 7).

表4 魚腥草水提物及3種多糖體外抗病毒結(jié)果

圖5 魚腥草水提物及3種多糖體外抗三種病毒TI值比較(t檢驗(yàn))Fig.5 Comparison of TI virus values of water extracts and 3 polysaccharides from Houttuynia cordata in vitro (t test)注：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，#P > 0.05。

對(duì)EV71的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對(duì)其治療指數(shù)分別為：Y1-24.05；Y2-2.732 2；Y3-12.593 3；Y4-6.392 2。通過對(duì)各組間進(jìn)行兩兩比較的組間t檢驗(yàn)(結(jié)果如圖5)，發(fā)現(xiàn)Y1與Y3之間，雖然Y1在均值上占有優(yōu)勢(shì)，然而兩者組間比較P值大于0.05，沒有顯著區(qū)別，可視為效果大致相同；其他各組兩兩比較P值均小于0.05，具有顯著不同。因此可認(rèn)為這四種產(chǎn)物對(duì)EV71的抑制效果優(yōu)劣為Y1≈Y3>Y4>Y2。

對(duì)RSV的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對(duì)其治療指數(shù)分別為：Y1-2.464 5；Y2-5.431 5；Y3-15.565 3；Y4-9.724 6。對(duì)各組間進(jìn)行兩兩比較的組間t檢驗(yàn)(結(jié)果如圖5)，P值均小于0.05，各組兩兩之間均有顯著區(qū)別，可視為效果顯著不同。因此可認(rèn)為這四種產(chǎn)物對(duì)RSV的抑制效果優(yōu)劣為Y3>Y4>Y2>Y1。

對(duì)CV-B3的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對(duì)其治療指數(shù)分別為：Y1-2.807 6；Y2-5.339 8；Y3-17.86；Y4-5.98。對(duì)各組間進(jìn)行兩兩比較的組間t檢驗(yàn)(結(jié)果如圖5)，發(fā)現(xiàn)Y2與Y4之間，雖然Y4在均值上占有一定優(yōu)勢(shì)，然而兩者組間比較P值大于0.05，沒有顯著區(qū)別，可視為效果大致相同；其他各組兩兩比較P值均小于0.05，具有顯著不同。因此可認(rèn)為這四種產(chǎn)物對(duì)CV-B3的抑制效果優(yōu)劣為Y3>Y4≈Y2>Y1。

4 討論

為了探究魚腥草水提物抗病毒能力與其中所含多糖的關(guān)系，我們采用酶解法、酶解法-Sevag純化魚腥草多糖，測(cè)其多糖含量及體外抗病毒活性，以期找出魚腥草多糖與其抗病毒能力的關(guān)系。

從魚腥草經(jīng)不同制備方法所得提取物的得率及多糖純度結(jié)果看，得率方面：S3S4>S2>S1，兩者成反比關(guān)系，說明酶解和Sevage法除蛋白可以提高樣品的多糖純度；同時(shí)，除去魚腥草水提液直接凍干產(chǎn)物對(duì)EV71病毒的抑制效果外，魚腥草的不同處理方法所得凍干產(chǎn)物的抗病毒效果趨勢(shì)與其中多糖純度趨勢(shì)基本一致，由此可推測(cè)魚腥草對(duì)RSV、CV-B3兩種病毒的抑制可能主要是魚腥草中的多糖在發(fā)揮作用。

魚腥草的水提液凍干產(chǎn)物(Y1)的抗病毒效果在EV71和RSV、CV-B3病毒的抑制效果方面存在很大的差異，魚腥草水提液對(duì)于EV71病毒有著最佳的抑制效果，而對(duì)于RSV、CV-B3兩種病毒，其抑制作用在四種產(chǎn)物中是最差的，在醇沉的上清液部位可能存在除多糖以外的EV71的抑制劑，其抗病毒的效果及作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

天然藥物多糖抗病毒機(jī)制主要有對(duì)病毒的直接抑制與滅殺、抑制病毒進(jìn)行生物合成與增殖、阻滯病毒的吸附與進(jìn)入細(xì)胞、以及對(duì)宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等[18]。魚腥草多糖有著很好的抗氧化效果[2,19],抗氧化與免疫調(diào)節(jié)有著密切的聯(lián)系，同時(shí)，多糖的抗氧化效果對(duì)一些病毒的抑制也密切相關(guān)[20]。魚腥草多糖在本實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)的抗病毒效果可能與其抗氧化能力相關(guān)。

本研究對(duì)于魚腥草多糖的體外抗病毒效果進(jìn)行了一定的研究，為魚腥草多糖的抗病毒能力提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與數(shù)據(jù)。魚腥草多糖對(duì)于RSV和CV-B3病毒的抗病毒作用總體上隨多糖純度的上升而增強(qiáng)，而對(duì)于EV71病毒，未經(jīng)處理的魚腥草水提液的抗病毒作用效果與多糖濃度最高的Y3相似，而其他三種產(chǎn)物的抑制效果依然與多糖純度呈正相關(guān)。