夾竹桃葉內(nèi)生真菌Colletotrichum sp.HK-08的次生代謝產(chǎn)物及其活性研究

鄭 浩，梅文莉，蔡彩虹，蓋翠娟，戴好富，譚志瓊，陳惠琴*

1海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228；2海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101

植物內(nèi)生真菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖在植物體內(nèi)，而對(duì)植物沒(méi)有明顯負(fù)面影響的一類真菌[1]。有研究表明，大部分植物體內(nèi)都含有1種或多種內(nèi)生真菌[2]，隨著自然界長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇，真菌與宿主之間形成了動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系。在宿主的生長(zhǎng)周期中，內(nèi)生真菌在一定程度上具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)[3]，提高宿主植物的抗病蟲(chóng)害[4]，以及抵御環(huán)境壓力的作用[5]。另外據(jù)報(bào)道，內(nèi)生真菌與宿主植物次生代謝產(chǎn)物的累積也有著密不可分的關(guān)系[6]。

夾竹桃(NeriumindicumMill.)葉具有毒性但同時(shí)在治療心臟病、心力衰竭等方面也具有較好的作用[7]。目前，關(guān)于夾竹桃葉內(nèi)生真菌的研究鮮有報(bào)道，為了研究這一特殊植物體內(nèi)的共生微生物，從其健康葉片中共分離鑒定了16株內(nèi)生真菌，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，其中發(fā)現(xiàn)菌株Colletotrichumsp.HK-08的大米發(fā)酵產(chǎn)物中次生代謝產(chǎn)物不僅化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富，而且具有較好的生物活性。通過(guò)各種色譜手段從中共分離鑒定了11個(gè)化合物，分別為butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(1)、4-hydroxyphenethyl acetate(2)、phenethyl 2-phenylacetate(3)、phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(4)、4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl)acetate(5)、4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、對(duì)羥基苯甲醛(7)、2-羥基苯乙醇(8)、對(duì)羥基苯甲酸(9)、對(duì)羥基苯乙酮(10)和3a-hydroxyindoline(11)。在此基礎(chǔ)上對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了生物活性測(cè)試，在一定程度上豐富了Colletotrichum屬真菌次生代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和生物活性。

1 材料

1.1 菌株

真菌HK-08分離自海南省?？谑泻Ｄ洗髮W(xué)校園內(nèi)的健康夾竹桃葉片，現(xiàn)保藏于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，標(biāo)本編號(hào)為：20180809HK-08。

1.2 儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph Laborota)，核磁共振波譜儀(Brucker AV-500，以TMS為內(nèi)標(biāo))，質(zhì)譜儀(Micromass Autospec-Uitima TOF)，安捷倫1260分析型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，SUMMITP680A半制備高效液相色譜儀(戴安，美國(guó))，ELX-800酶標(biāo)儀(Bio Tex公司)，超純水裝置(廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司)，超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，Sephadex LH-20(Merck公司)，C18反相材料(FU-JI公司)，柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠產(chǎn)品)，氘代試劑(CD3OD和CDCl3)購(gòu)自Merck公司，色譜乙腈購(gòu)自天津康科德公司；其他試劑均為重蒸工業(yè)試劑。

1.3 培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。(2)大米固體培養(yǎng)基：每100 g大米加入100 mL無(wú)菌水，置于1 L三角瓶中。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離

將葉片表面清洗干凈，然后依次用75%乙醇浸泡1 min，0.1%的升汞浸泡2 min，無(wú)菌水漂洗3次以進(jìn)行表面滅菌。接著將葉片置于培養(yǎng)皿中，上下表面均與培養(yǎng)基相接觸后取出，以此培養(yǎng)皿作為對(duì)照組。取出的葉片將其剪成1 cm × 1 cm的方塊，貼于新的含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～15天。對(duì)照培養(yǎng)基中無(wú)真菌長(zhǎng)出，證明表面滅菌徹底，分離得到的真菌是植物內(nèi)生真菌。挑取葉片切口處長(zhǎng)出的菌絲體，接種到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，并純化得到單一菌株，得到的單菌落接種在PDA斜面上編號(hào)并4 ℃保存。

2.2 菌株鑒定

將真菌HK-08接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7天，觀察菌落的形態(tài)特征。使用試劑盒[OMEGA Fungal DNA Kit(50)]提取DNA，以ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)作為引物(上海生工生物工程股份有限公司)，對(duì)該菌株ITS序列進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果提交于NCBI基因庫(kù)，并與BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，并利用軟件MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 菌株發(fā)酵

真菌在PDA培養(yǎng)基中活化后，挑取單個(gè)菌落接種到裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28 ℃，200 rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)2天，得到種子液，在含有大米培養(yǎng)基的1 L三角瓶(70瓶)中接入10 mL種子液，靜置培養(yǎng)30天。

2.4 提取與分離

菌株發(fā)酵結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取三遍，回收合并乙酸乙酯相，減壓濃縮，獲得乙酸乙酯提取物(198.0 g)。將提取物用95%甲醇水溶解，以1∶1用石油醚萃取，除去石油醚層，減壓濃縮得到88.0 g膏狀粗提物，經(jīng)過(guò)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1～0∶1)梯度洗脫，得到15個(gè)流份(Fr.1～Fr.15)。Fr.1(2.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(氯仿∶甲醇 = 1∶1為流動(dòng)相)分離得到7個(gè)流份Fr.1-1～Fr.1-7。Fr.1-3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物3(22.0 mg)。Fr.3(7.0 g)經(jīng)C18反相硅膠柱色譜梯度洗脫得到10個(gè)流份Fr.3-1～Fr.3-10，其中Fr.3-5與Fr.3-6合并后經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物1(12.0 mg)、2(3.0 mg)、4(40.0 mg)。Fr.8(7.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(甲醇為流動(dòng)相)分離得到10個(gè)流份Fr.8-1～Fr.8-10。Fr.8-4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物7(2.0 mg)、8(3.0 mg)、9(6.0 mg)、10(1.5 mg)。Fr.8-6(320.0 mg)經(jīng)減壓硅膠柱(石油醚：乙酸乙酯 = 50∶1為流動(dòng)相)色譜，得到8個(gè)流份Fr.8-6-1～Fr.8-6-8，其中Fr.8-6-3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物5(2.6 mg)、6(5.0 mg)；Fr.8-6-5經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱，乙腈-水V∶V = 21∶79為流動(dòng)相，流速4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220、245 nm)，得到化合物11(0.9 mg，tR19.0 min)。

2.5 細(xì)胞毒活性測(cè)試

采用MTT法對(duì)化合物1～6、9和10進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試。供試腫瘤細(xì)胞包括：K562人慢性髓原白血病細(xì)胞、BEL-7402肝癌細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、Hela 人宮頸癌細(xì)胞，供試細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。以相同濃度的DMSO溶劑作為陰性對(duì)照組，順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照組。將待測(cè)樣品分別設(shè)：1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 mg/ mL 6個(gè)濃度梯度。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在96孔板上。細(xì)胞K562直接加入10 μL樣品，其余腫瘤細(xì)胞株需在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，再加入10 μL樣品。培養(yǎng)72 h后，在顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞的形態(tài)。將15 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液加入到每孔細(xì)胞中，置于37 °C反應(yīng)4 h后，棄去上清液，每孔中加入150 μL DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔的OD值(490 nm為測(cè)量波長(zhǎng))。計(jì)算其抑制率為50%的時(shí)候樣品濃度即IC50值。

抑制率 = (對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/

對(duì)照組OD值×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株鑒定

菌株初始長(zhǎng)出的菌絲均為無(wú)色，后變?yōu)榛疑?，菌落背面為深灰色及少許褐色，其孢子呈兩端鈍圓的圓柱狀。將擴(kuò)增的序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取與其同源性較高的菌株，使用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)

圖1 基于ITS序列同源性的真菌HK-08的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain HK-08

結(jié)果顯示，菌株HK-08與Colletotrichumsp.(KM036382.1)在同一分支上，且與其BLAST同源比對(duì)相似度達(dá)99%，因此，鑒定該菌株HK-08為真菌Colletotrichumsp.HK-08。

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無(wú)色油狀(CHCl3)；分子式為C12H16O3；ESI-MS：m/z231.2[M + Na]+；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.13(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3，5)，3.54(2H，s，H-7)，4.08(2H，t，J= 6.7 Hz，H-9)，1.60(2H，m，H-10)，1.34(2H，m，H-11)，0.91(3H，t，J= 7.4 Hz，H-12)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：126.3(C-1)，130.6(C-2，6)，115.6(C-3，5)，154.9(C-4)，40.7(C-7)，172.5(C-8)，65.0(C-9)，30.7(C-10)，19.2(C-11)，13.9(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，確定化合物1為butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate。

化合物2無(wú)色油狀(CHCl3)；分子式為C10H12O3；ESI-MS：m/z181.2[M + H]+；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.08(2H，d，J= 7.9 Hz，H-2，6)，6.77(2H，d，J= 8.1 Hz，H-3，5)，5.17(1H，s，4-OH)，4.23(2H，t，J= 7.1 Hz，H-8)，2.86(2H，t，J= 7.1 Hz，H-7)，2.04(3H，s，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：129.9(C-1)，130.2(C-2，6)，115.5(C-3，5)，154.5(C-4)，34.3(C-7)，65.4(C-8)，171.5(C-9)，21.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，確定化合物2為4-hydroxyphenethyl acetate。

化合物3無(wú)色油狀(CHCl3)，分子式為C16H16O2；ESI-MS：m/z263.3[M + Na]+；1H NMR譜給出兩個(gè)單取代苯環(huán)的10個(gè)質(zhì)子信號(hào)：δH7.23～7.36(8H，m，H-2，3，4，5，6，13，14，15)，7.18(2H，d，J= 8.1 Hz，H-12，16)；3個(gè)亞甲基信號(hào)：δH4.34(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.63(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10);13C NMR譜顯示該化合物共有16個(gè)碳原子，其中包括12個(gè)苯環(huán)碳，3個(gè)亞甲基碳δC41.6(C-7)，65.5(C-9)，35.2(C-10)和1個(gè)羰基碳δC171.7(C-8)。1H-1H COSY譜中H2-9與H2-10有相關(guān)信號(hào)。HMBC譜中，亞甲基質(zhì)子H2-7與C-1、2、6、8有相關(guān)信號(hào)，H2-9與C-8、10、11有相關(guān)信號(hào)，亞甲基質(zhì)子H2-10與C-9、11、12、16有相關(guān)信號(hào)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.23～7.36(8H，m，H-2，3，4，5，6，13，14，15)，7.18(2H，d，J= 8.1 Hz，H-12，16)，4.34(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.63(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：133.9(C-1)，126.7～129.4(10C，Ar-C)，41.6(C-7)，171.7(C-8)，65.5(C-9)，35.2(C-10)，137.8(C-11)。綜合以上信息，確定化合物3為phenethyl 2-phenylacetate[10]，并且首次報(bào)道其核磁數(shù)據(jù)。

化合物4無(wú)色油狀(CHCl3)；分子式為C16H16O3；ESI-MS：m/z279.3[M + Na]+；1H NMR譜中呈現(xiàn)了一個(gè)單取代苯環(huán)的氫信號(hào)：δH：7.24～7.33(3H，m，H-13，14，15)，7.19(2H，d，J= 7.4 Hz，H-12，16)；一個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)的氫信號(hào)：7.10(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)；3個(gè)亞甲基信號(hào)：δH4.33(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.55(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)。13C NMR譜中顯示該化合物共有16個(gè)碳原子，其中包括12個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)δC125.8(C-1)，130.6(C-2，6)，115.7(C-3，5)，155.0(C-4)，137.8(C-11)，128.6-129.1(C-12，13，15，16)，126.7(C-14)；3個(gè)亞甲基碳δC40.6(C-7)，65.6(C-9)，35.1(C-10)；1個(gè)羰基碳δC172.5(C-8)。1H-1H COSY譜中H2-9與H2-10有相關(guān)信號(hào)。HMBC譜中，亞甲基質(zhì)子H2-7與C-1、2、6、8有相關(guān)信號(hào)，H2-9與C-8、10、11有相關(guān)信號(hào)，亞甲基質(zhì)子H2-10與C-9、11、12、16有相關(guān)信號(hào)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.24～7.33(3H，m，H-13，14，15)，7.19(2H，d，J= 7.4 Hz，H-12，16)，7.10(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)，4.33(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.55(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：125.8(C-1)，130.6(C-2，6)，115.7(C-3，5)，155.0(C-4)，40.6(C-7)，172.5(C-8)，65.6(C-9)，35.1(C-10)，137.8(C-11)，128.6-129.1(C-12，13，15，16)，126.7(C-14)。確定化合物4為phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate[11]，并且首次報(bào)道其核磁數(shù)據(jù)。

化合物5黃色油狀(CH3OH)；分子式為：C16H16O4；ESI-MS：m/z273.3[M + H]+；1H NMR譜中呈現(xiàn)了一個(gè)鄰位取代苯環(huán)的氫信號(hào)：7.09(2H，m，H-4，6)，6.78(2H，m，H-3，5)；一個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)的氫信號(hào)：6.97(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.69(2H，d，J= 8.4 Hz，H-13，15)；3個(gè)亞甲基信號(hào)：4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.57(2H，s，H-7)，2.79(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)。13C NMR譜中給出了16個(gè)碳信號(hào)，包括12個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)，3個(gè)亞甲基信號(hào)和1個(gè)羰基信號(hào)。1H-1H COSY譜中H2-9與H2-10有相關(guān)信號(hào)。HMBC譜中，亞甲基質(zhì)子H2-7與C-1、2、6、8有相關(guān)信號(hào)，H2-9與C-8、10、11有相關(guān)信號(hào)，亞甲基質(zhì)子H2-10與C-9、11、12、16有相關(guān)信號(hào)。1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.09(2H，m，H-4，6)，6.97(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.78(2H，m，H-3，5)，6.69(2H，d，J= 8.4 Hz，H-13，15)，4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.57(2H，s，H-7)，2.79(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：122.5(C-1)，156.7(C-2)，115.3(C-3)，129.3(C-4)，120.5(C-5)，132.1(C-6)，36.7(C-7)，174.2(C-8)，66.9(C-9)，35.3(C-10)，130.2(C-11)，130.9(C-12，16)，116.2(C-13，15)，156.9(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，確定化合物5為4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl) acetate。

化合物6無(wú)色油狀(CH3OH)；分子式為C16H16O4；ESI-MS：m/z273.3[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.01(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2，6)，6.96(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.66～6.73(4H，m，H-3，5，13，15)，4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.47(2H，s，H-7)，2.78(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：126.3(C-1)，130.1(C-2，6)，116.3(C-3，5)，156.9(C-4)，41.3(C-7)，174.0(C-8)，66.9(C-9)，35.1(C-10)，129.9(C-11)，131.3(C-12，16)，116.2(C-13，15)，157.5(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，確定化合物6為4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate。

化合物7淺黃色晶體(CH3OH)；分子式為C7H6O2；ESI-MS：m/z123.1[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：9.72(1H，s，H-7)，7.74(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2，6)，6.88(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：130.1(C-1)，133.4(C-2，6)，116.9(C-3，5)，165.5(C-4)，192.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，確定化合物7為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物8淡黃色油狀(CH3OH)；分子式為C8H10O2；ESI-MS：m/z139.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.03(1H，d，J= 7.5 Hz，H-3)，6.98(1H，t，J= 7.7 Hz，H-5)，6.71(1H，d，J= 7.6 Hz，H-6)，6.70(1H，t，J= 7.6 Hz，H-4)，3.70(2H，t，J=7.0 Hz，H-8)，2.79(2H，t，J= 7.1 Hz，H-7)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：156.4(C-1)，126.6(C-2)，131.8(C-3)，120.5(C-4)，128.4(C-5)，116.1(C-6)，35.1(C-7)，63.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，確定化合物8為2-羥基苯乙醇。

化合物9白色晶體(CH3OH)；分子式為C7H6O3；ESI-MS：m/z139.1[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.87(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3，5)，6.81(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2，6)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：163.7(C-1)，115.8(C-2，6)，131.7(C-3，5)，122.8(C-4)，169.3(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，確定化合物9為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物10白色粉末(CH3OH)；分子式為C8H8O2；ESI-MS：m/z137.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.85(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，6.80(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6)，2.49(3H，s，H-8)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：162.8(C-1)，115.6(C-2，6)，130.0(C-3，5)，129.1(C-4)，197.1(C-7)，26.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，確定化合物10為對(duì)羥基苯乙酮。

化合物11黃色油狀(CH3OH)；分子式為：C10H11NO2；ESI-MS：m/z178.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.26(1H，d，J= 7.5 Hz，H-4)，7.09(1H，t，J= 7.6 Hz，H-6)，6.74(1H，t，J= 7.4 Hz，H-5)，6.60(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7)，5.35(1H，s，H-8a)，4.00(1H，ddd，J= 8.7，8.0，2.5 Hz，H-3α)，3.61(1H，ddd，J= 9.7，9.2，5.3 Hz，H-3β)，2.37(1H，ddd，J= 11.2，10.8，7.3 Hz，H-2α)，2.27(1H，ddd，J= 11.9，5.3，2.5 Hz，H-2β)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：67.8(C-2)，42.4(C-3)，90.0(C-3a)，132.1(C-3b)，125.1(C-4)，119.9(C-5)，130.8(C-6)，110.3(C-7)，151.7(C-7a)，101.4(C-8a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，確定化合物11為3a-hydroxyindoline。

3.3 細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)

對(duì)化合物1～6、9和10進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，結(jié)果顯示，僅化合物4和6對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒活性，其他化合物并未表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，活性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物4和6的細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果

注：a陽(yáng)性對(duì)照。

Note:aPositive control.

4 討論

本研究運(yùn)用多種色譜技術(shù)從夾竹桃葉內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.HK-08中分離得到11個(gè)化合物，均為聚酮類化合物，其中包括6個(gè)含苯乙基或苯乙?；Y(jié)構(gòu)的酯類化合物：butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(1)、4-hydroxyphenethyl acetate(2)、phenethyl 2-phenylacetate(3)、phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(4)、4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl)acetate(5)、4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(6)；4個(gè)簡(jiǎn)單的苯酚類化合物：對(duì)羥基苯甲醛(7)、2-羥基苯乙醇(8)、對(duì)羥基苯甲酸(9)、對(duì)羥基苯乙酮(10)；以及1個(gè)生物堿類化合物：3a-hydroxyindoline(11)。本文首次報(bào)道了化合物3和4的核磁數(shù)據(jù)，化合物4、5和11為新的天然產(chǎn)物，化合物1～6和11為首次從Colletotrichum屬真菌中分離得到，豐富了Colletotrichum屬真菌的次生代謝產(chǎn)物?；衔?和6表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒活性，比較化合物3、4、5和6的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中4號(hào)位的酚羥基可能對(duì)活性起到了重要作用，但還需更多的研究進(jìn)一步驗(yàn)證，此外，化合物1～6、9和10在對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等人體病原菌的抗性實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出抗菌活性。