華澤蘭花部位化學成分及其抑菌活性研究

陳 禹，孫志瀅，楊宇純，蘭佳慧，楊 霞，程 凡，劉呈雄，鄒 坤

三峽大學生物與制藥學院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

華澤蘭EupatoriumChinenseL.系菊科(Compositae)澤蘭屬EupatoriumL.植物，為多年生草本或半灌木，多生長于林緣、山谷、灌木叢或草地中，主要分布于我國的東南到西南各省份。其中鄂西地區(qū)主要分布于湖北省長陽縣，本課題組前期資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長陽縣山谷、灌木叢中生長著大量的華澤蘭植物[1]?！陡＝ㄋ幬镏尽分忻枋銎洹笆娓谓庥簟㈤_胸利膈、調(diào)經(jīng)行血、消腫止痛。主治感冒、胸脅痛、胃痛、腹脹、產(chǎn)后浮腫、產(chǎn)后瘀血痛、月經(jīng)不調(diào)、風濕關(guān)節(jié)癰、跌打損傷、蛇傷、臁瘡等” 。其干燥根部，別名廣東土牛膝、大澤蘭、六月雪等，民間用于治療白喉、咽喉腫痛、蛾喉等癥，有“喉科圣藥”之稱。國內(nèi)外學者對其葉、莖、根部化學成分進行了大量的研究，其主要成分為黃酮類、萜類、苯并呋喃類、酚類及有機酸類[2]。文獻報道其中苯并呋喃類化合物及其多聚體具有良好的抗腫瘤，抗炎，抗菌，抗病毒等活性[2-9]。

本實驗室在前期研究中已從華澤蘭根、莖和葉中分離得到70余個化合物[4-9]，華澤蘭莖和葉部位的主要成分為倍半萜類[7,9]；華澤蘭根部位的主要成分為苯丙呋喃類[5]。其中苯并呋喃類化合物及其多聚體具有良好的腫瘤細胞毒活性[4]。從已發(fā)表文獻來看，尚未有對華澤蘭花部位的研究。本課題組前期已經(jīng)對華澤蘭的根、莖和葉進行了系統(tǒng)的研究，為進一步系統(tǒng)的對華澤蘭的其余部位的化學成分進行研究，本文首次對華澤蘭花部位的化學成分及抗菌活性進行了研究，分離并鑒定了9個化合物，研究發(fā)現(xiàn)花部位主要成分為黃酮類和萜類，其中3個齊墩果烷型五環(huán)三萜，為華澤蘭中首次分離得到，推測五環(huán)三萜類為華澤蘭花部分的特征成分。文獻報道化合物8和9(苯并呋喃類化合物)具有良好的抑菌活性[10]，為豐富華澤蘭系統(tǒng)研究，對花部位分離得到化合物進行抑菌活性篩選，選取從三峽地區(qū)自然腐爛的柑橘果實上分離出優(yōu)勢致腐菌橘青霉和常見的金黃色葡萄球菌作為供試菌，以期為新的天然柑橘保鮮劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果表明化合物1和4對供試菌均具有較好的抑菌活性，化合物2、5、6具有弱抑菌活性。本文的研究結(jié)果對華澤蘭各部位的特征化學成分確定及植物資源開發(fā)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400 核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Waters 1525EF高效液相色譜(美國Waters公司)；Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×10 mm，10 μm，半制備型；250 mm×4.6 mm，5 μm，分析型，天津博納艾杰爾科技有限公司)；低溫冷凍干燥機(美國 Labconco公司)；正相色譜硅膠(煙臺化學工業(yè)研究所)；反相色譜硅膠(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(美國Pharmacia公司)；MCI GEL(日本三菱化學)；高效液相用乙腈、甲醇均為色譜純(美國Tedia公司)，水為三蒸水；低溫離心機(德國 Eppendorf公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(上海民橋精密儀器有限公司)；其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 材料與菌種

華澤蘭材料于2018 年9月采自湖北長陽，經(jīng)三峽大學生物技術(shù)中心王玉兵副教授鑒定為EupatoriumchinenseL.。植物標本(No.201507162)現(xiàn)保存于三峽大學天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室。

試驗所選菌種：從三峽地區(qū)自然腐爛的柑橘果實上分離出優(yōu)勢致腐菌，鑒定為橘青霉(Penicilliumcitrinum)，命名為PC-1(GenBank 登錄號：MK953483)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(CMCC(B)26003)。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：新鮮的去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖 20.0 g， 瓊脂20.0 g，自然pH，0.1 MPa，滅菌20 min。

NB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏6 g，蛋白胨20 g，氯化鈉20 g，瓊脂10 g，自然pH，0.1 Mpa，滅菌20分鐘。

1.3 提取與分離

取干燥的華澤蘭花1 kg，使用95%乙醇冷浸超聲提取3次，每次12 h，提取液合并過濾，減壓蒸餾，得到浸膏15 g。將所得的浸膏與水充分混旋，依次使用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別得到浸膏4 g和6 g。取乙酸乙酯部位6 g，過MCI凝膠色譜柱甲醇-水 (10∶90～1∶0)分離，得到10個片段(Fr.1～10)。取Fr.5過HW-40F凝膠色譜柱，得兩個部位，進行高效液相色譜半制備分離純化(乙腈-水 = 50∶50，3 mL/min)，得到化合物1(3.0 mg)、6(3.5mg)、7(4 mg)。取Fr.6片段，進行高效液相色譜半制備分離純化(甲醇-水 = 60∶400，3 mL/min)，得到化合物4(4 mg)、5(3.2 mg)、3(4.3 mg)、2(5.1 mg)。取Fr.8片段，高效液相色譜半制備分離純化(乙腈-水 = 80∶20，3 mL/min)，得到化合物8(2.8 mg)、9(3 mg)。

化合物結(jié)構(gòu)均采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)波譜方法鑒定，并與文獻對照確定化合物1～9的結(jié)構(gòu)。

1.4 抑菌活性測定

為了評價華澤蘭花部位化合物的抑菌活性，采用牛津杯法[11]測定離體條件下化合物對橘青霉PC-1/金黃色葡萄球菌生長的影響。牛津杯法：取生長3～4天的橘青霉PC-1和金黃色葡萄球菌，橘青霉用無菌水洗下菌苔后過濾掉菌絲體，金黃色葡萄球菌直接用無菌水洗下，顯微鏡下進行計數(shù)后，稀釋成106CFU/mL的孢子懸液備用，將400 μL橘青霉孢子懸液均勻涂布于PDA固體平板中，將400 μL金黃色葡萄球菌孢子懸液均勻涂布于NB固體平板中，將無菌的牛津杯豎立于培養(yǎng)基表面，每個牛津杯中滴入200 μL的樣品溶液，28 °C下培養(yǎng)2～3天后，觀察抑菌效果并測定抑菌圈直徑。實驗中以市售的柑橘生物保鮮劑百可得(40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽iminoctadine trialbesilate)和氨芐西林(ampicillin)為正對照。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色片狀結(jié)晶，易溶于氯仿；mp.243～247 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：0.91，0.93，0.94，1.11，1.14，1.21，1.29，1.31(all s，8×Me)，2.67(1H，m，H-2a)，2.99(1H，m，H-2b)，2.40(1H，s，H-9)，5.67(1H，s，H-12)，2.47(1H，m，H-18)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：39.7(C-1)，32.4(C-2)，217.4(C-3)，47.8(C-4)，55.4(C-5)，18.8(C-6)，33.0(C-7)，36.7(C-8)，61.0(C-9)，34.8(C-10)，200.1(C-11)，128.0(C-12)，171.2(C-13)，43.5(C-14)，28.8(C-15)，26.9(C-16)，33.1(C-17)，48.3(C-18)，45.8(C-19)，31.7(C-20)，35.0(C-21)，37.1(C-22)，24.4(C-23)，19.1(C-24)，16.3(C-25)，22.0(C-26)，27.0(C-27)，24.1(C-28)，13.2(C-29)，23.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]一致，故鑒定該化合物為3，11-二氧，Δ12-齊墩果烯。

化合物2無定型粉末，易溶于甲醇；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：1.31(2H，H-1)，1.41(2H，m，H-2)，4.47(1H，dd，J= 11.6 Hz，4.6 Hz，H-3a)，1.35(1H，H-5)，1.29(2H，m，H-6)，1.38(2H，m，H-7)，2.33(1H，s，H-9)，5.65(1H，s，H-12)，1.25(2H，m，H-15)，1.73(2H，m，H-16)，2.88(1H，dd，J= 13.6 Hz，6.35，H-18)，1.20(2H，m，H-19)，1.18(2H，m，H-21)，1.25(2H，m，H-22)，0.85(3H，s，Me-23)，0.85(3H，s，Me-24)，1.11(3H，s，Me-25)，0.91(3H，s，Me-26)，1.34(3H，s，Me-27)，0.92(3H，s，Me-29)，0.92(3H，s，Me-30)，2.27(2H，t，J= 7.5 Hz，H-2′)，1.6(2H，m，H-3′)，1.2(2H，m，H-4′)，1.2(2H，m，H-5′)，1.2(2H，m，H-6′)，1.2(2H，m，H-7′)，0.87(3H，t，J= 7.7 Hz，Me-8′)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：38.7(C-1)，28.9(C-2)，80.0(C-3)，38.2(C-4)，54.4(C-5)，17.1(C-6)，33.0(C-7)，43.4(C-8)，62.6(0C-9)，37.2(C-10)，203.2(C-11)，128.1(C-12)，166.2(C-13)，45.1(C-14)，27.3(C-15)，24.4(C-16)，45.9(C-17)，40.4(c-18)，44.2(C-19)，30.6(C-20)，33.7(C-21)，31.9(C-22)，28.1(Me-23)，16.6(Me -24)，16.7(Me -25)，19.2(Me-26)，23.1(Me -27)，178.5(C-28)，32.8(Me -29)，23.4(Me-30)，173.1(C-1′)，34.7(C-2′)，23.1(C-3′)，29.8(C-4′)，29.3(C-5′)，31.6(C-6′)，22.2(C-7′)，14.0(Me-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，故鑒定該化合物為3β-(辛烷氧基)-11-氧代烯烴-12-烯-28-酸(madhucic acid)。

化合物3白色結(jié)晶，易溶于甲醇，mp.196～198 °C；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：0.81，0.84，0.88，0.89，0.98，1.00，1.02，1.04(all s，8 × Me)，3.26(dd，J= 10.4 Hz，5.4，H-3)，5.23(t，J= 3.6 Hz，H-12)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：38.6(C-1)，26.9(C-2)，79.0(C-3)，37.1(C-4)，55.2(C-5)，18.4(C-6)，32.6(C-7)，39.8(C-8)，47.2(C-9)，37.0(C-10)，23.5(C-11)，121.7(C-12)，145.2(C-13)，41.7(C-14)，28.4(C-15)，26.2(C-16)，32.7(C-17)，47.6(C-18)，46.8(C-19)，31.1(C-20)，34.7(C-21)，37.2(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，15.5(C-25)，16.8(C-26)，26.0(C-27)，27.2(C-28)，33.3(C-29)，23.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，故鑒定該化合物為β-香樹脂醇。

化合物4黃色粉末，易溶于甲醇。mp.259～262 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：8.96(2H，d，J= 7.0 Hz ，H-2′)，6.91(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3′，5′)，6.45(1H，d，J= 3.0 Hz，H-8)，6.24(1H，d，J= 3.0 Hz，H-6)，5.26(1H，d，J= 7.0 Hz，H-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：156.4(C-2)，133.6(C-3)，177.7(C-4)，101.5(C-10)，121.4(C-1′)，131.3(C-2′，6′)，115.6(C-3′，5′)，160.5(C-4′)，102.1(C-1′′)，70.4(C-2′′)，74.7(C-3′′)，68.3(C-4′′)，76.9(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15,16]報道基本一致，故鑒定該化合物為山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物5無色方晶，易溶于丙酮，甲醇；mp.144～145 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：7.50(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，7.06(1H，d，J= 1.6Hz，H-2)，7.00(1H，dd，J= 2.4，2.0 H z，H-6)，6.78(1H，d，J= 8.0Hz，H-5)，6.30(1H，d，J=16Hz，H-8)，4.17(2H，q，H-10)，1.25(3H，t，H-11)。13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：167.0(C-9)，148.9(C-4)，146.1(C-7)，145.5(C-3)，126.0(C-6)，121.8(C-1)，116.2(C-5)，115.3(C-8)，114.5(C-2)，60.2(C-10)，14.7(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為咖啡酸乙酯。

化合物6白色無定型粉末，易溶于甲醇；1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δH：1.20(6H，d，J= 7.0 Hz，H-9，10)，2.21(3H，s，H-7)，3.30(1H，m，H-8)，3.42(4H，m，H-2′，3′，4′，5′ )，3.70(1H，dd，J= 12.0 Hz，5.0 Hz，H-6a′ )，3.88(1H，dd，J= 12Hz，2.0 Hz，H-6b′ )，4.84(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′)，6.78(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，6.96(1H，s，H-2)，7.15(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：136.2(C-1)，116.3(C-2)，155.1(C-3)，134.6(C-4)，127.5(C-5)，125.9(C-6)，21.1(C-7)，26.1(C-8)，23.5(C-9)，23.2(C-10)，101.8(C-1′)，74.0(C-2′)，77.5(C-3′)，70.4(C-4′)，77.4(C-5′)，61.3(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故鑒定該化合物為5-甲基-2(1-甲基乙基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物7無色膠質(zhì)，易溶于氯仿；mp.85～86 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：5.28(1H，m，H-1)，2.65，2.37(2H，m，H-2a，H-2b)，5.09(1H，br.s，H-3)，5.21(1H，m，H-5)，5.69(1H，m，H-6)，3.19(1H，m，H-7)，5.18(1H，m，H-8)，3.04，2.29(2H，m，H-9a，H-9b)，6.17，5.98(2H，2br.s，H-13a，H-13b)，4.36，3.80(2H，2d，J=12.6 Hz，H-14a，H-14b)，1.77(1H，s，Me)，6.64(1H，br.s，H-3′)，4.13(2H，m，H-4′)，1.70(1H，s，H-5′)，2.02(1H，s，MeCOO)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：126.1(C-1)，35.9(C-2)，77.2(C-3)，144.8(C-4)，123.6(C-5)，75.6(C-6)，51.4(C-7)，72.6(C-8)，43.4(C-9)，134.0(C-10)，137.6(C-11)，166.2(C-12)，121.3(C-13)，19.3(C-14)，12.44(Me-15)，165.6(C-1′)，126.14(C-2′)，144.78(C-3′)，58.57(C-4′)，12.95(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故鑒定該化合物為eupalinolide K。

化合物8黃色針晶，易溶于甲醇，氯仿；mp.122～124 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：7.78(1H，s，H-4)，7.22(1H，s，H-7)，6.30(1H，s，H-3)，3.80(1H，dd，J= 6.0 Hz，12.0 Hz，H-11)，3.80(1H，dd，J= 6.0 Hz，11.0 Hz，H-11′ )，3.10(1H，m，H-10)，2.66(3H，s，H-9)，1.44(3H，d，J= 7.0 Hz，H-12)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：167.5(C-2)，106.4(C-3)，137.0(C-4)，111.8(C-5)，157.9(C-6)，102.0(C-7)，204.5(C-8)，25.5(C-9)，36.8(C-10)，64.7(C-11)，14.1(C-12)，147.9(C-13)，115.6(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，故鑒定該化合物為11-羥基-10，11-二氫澤蘭素。

化合物9黃色無定型粉末，易溶于氯仿；mp.217～219 ℃；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δH：7.86(1H，s，H-4)，7.95(1H，s，H-7)，3.12(1H，m，H-11a)，2.48(1H，m，H-11b)，4.72(1H，d，J= 10.0 Hz，H-12a)，4.46(1H，d，J= 10.0 Hz，H-12a)，2.60(1H，s，H-14)，6.72(1H，s，H-3′)，7.11(1H，s，H-4′)，7.86(1H，s，H-7′)，2.79，3.15(2H，m，H-11a′，H-11b′)，4.65，4.73(2H，d，J= 10.0 Hz，H-12a′，H-12b′)，2.60(1H，s，H-12a)，12.45(1H，s，6-OH)，12.66(1H，s，6′-OH)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δC：161.3(C-2)，117.0(C-3)，107.6(C-4)，158.0(C-5)，116.4(C-6)，112.6(C-7)，147.9(C-8)，136.4(C-9)，69.5(C-10)，29.7(C-11)，69.5(C-12)，204.5(C-13)，27.4(C-14)，165.6(C-2′)，103.9(C-3′)，107.6(C-4′)，158.0(C-5′)，116.4(C-6′)，112.1(C-7′)，147.8(C-8′)，134.6(C-9′)，44.4(C-10′)，28.9(C-11′)，65.7(C-12′)，204.4(C-13′)，25.6(C-14′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致，故鑒定該化合物為dieupachinin E。

2.2 抑菌活性篩選

對華澤蘭花部位中分離得到的化合物1～7進行抑菌活性篩選，結(jié)果如表1所示，供試化合物和正對照藥品濃度均配制為1 mg/mL，采用牛津杯抑菌圈法分別分析對橘青霉和金黃葡萄球菌的離體抑制效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，測試化合物對供試菌均具有不同程度的抑菌活性。其中，化合物化合物4對供試菌橘青霉(抑菌圈直徑13.1±1.4 mm)和金黃色葡萄球菌(抑菌圈直徑10.8±3.2 mm)均具有良好的抑菌活性?；衔?對金黃色葡萄球菌(抑菌圈直徑12.3±1.2 mm)具有較好的抑菌活性。其他測試化合物2、5、6對供試菌具有弱的抑制活性。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-9

表1 華澤蘭花部位化合物抑菌活性篩選(n =3)

注:表中抑菌圈直徑為3次結(jié)果的平均值，“-”表示抑菌圈直徑≤6.0 mm。

Note:Data were mean value of three parallel experiments;“-” indicated inhibitory zone was no more than 6.0 mm．

3 結(jié)論

本文為完善和豐富對華澤蘭植物不同部位的研究，以期更好的開發(fā)其藥用價值，對華澤蘭花部位進行系統(tǒng)分離，得到9個化合物，其中化合物1～7均為首次從該種屬中獲得，化合物1～3為齊墩果烷型五環(huán)三萜，為華澤蘭成分研究中首次報道，推測其為華澤蘭花部分的特征成分。同時對分離得到化合物進行抑菌活性篩選，選取金黃色葡萄球菌和三峽地區(qū)自然腐爛的柑橘果實上分離出優(yōu)勢致腐菌橘青霉作為供試菌，其中化合物4對供試菌橘青霉(抑菌圈直徑13.1±1.4 mm)和金黃色葡萄球菌(抑菌圈直徑10.8±3.2 mm)均具有良好的抑菌活性?；衔?對金黃色葡萄球菌(抑菌圈直徑12.3±1.2 mm)具有較好的抑菌活性。其他測試化合物2、5、6對供試菌具有弱的抑制活性。本文的研究結(jié)果為柑橘保鮮劑提供了先導化合物，為華澤蘭的開發(fā)利用提供了新的方向。

致謝：感謝三峽大學學位論文培優(yōu)基金項目資助(2019SSPY109)。