規(guī)?；i場(chǎng)糞污高效脫硫菌的分離、篩選與鑒定

劉雪純，耿曉晴，丁 軻,*，余祖華，李 旺，李元曉，何萬(wàn)領(lǐng)

（1.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471003；2.洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng) 471003）

目前，我國(guó)是世界上養(yǎng)殖量最大的國(guó)家，而且規(guī)?；潭仍絹?lái)越高。發(fā)達(dá)的養(yǎng)殖業(yè)一方面為人們提供了豐富的動(dòng)物性食品，提高了經(jīng)濟(jì)效益，也為解決就業(yè)問(wèn)題和農(nóng)民脫貧致富提供了可行之路；另一方面，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但畜禽糞污處理技術(shù)及相關(guān)設(shè)施沒(méi)能跟上，導(dǎo)致動(dòng)物糞尿釋放出大量NH3、H2S、吲哚、酚等，嚴(yán)重影響了周邊環(huán)境，其中NH3和H2S對(duì)空氣污染最嚴(yán)重[1-2]。近年來(lái)，國(guó)家逐步加快新農(nóng)村建設(shè)，并提出美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的美好藍(lán)圖，養(yǎng)殖場(chǎng)由南向北遷移也主要是基于環(huán)境考慮。為保證養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須做好畜禽糞便等污染物的無(wú)害化處理問(wèn)題。

畜禽糞便污染物包括重金屬（Fe、Cu、Zn等）、有機(jī)質(zhì)、病原微生物、NH3、H2S、CH4等，針對(duì)不同的污染物所需要的處理技術(shù)也不盡相同。當(dāng)前畜禽糞便污染物處理技術(shù)包括物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，其中物理方法處理一般較慢，僅對(duì)個(gè)別污染物有降解作用；化學(xué)方法成本較高，且易形成二次污染，在實(shí)際生產(chǎn)中很少使用；生物學(xué)方法主要是利用特異性微生物對(duì)目標(biāo)污染物進(jìn)行吸附、分解、代謝、轉(zhuǎn)化，充分利用了微生物作為自然界分解者的優(yōu)勢(shì)[3-4]。目前在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行糞污無(wú)害化處理時(shí)，主要檢測(cè)的指標(biāo)是生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）和化學(xué)需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）[5]。但是糞污中其他殘留物也可造成環(huán)境污染或生物富集，其中S2-是殘留在糞污中的有害物質(zhì)之一，該物質(zhì)不僅會(huì)腐蝕管道等金屬器具，而且可形成H2S或SO2等有害氣體，從而污染大氣環(huán)境，危害人和動(dòng)物的健康[6]。針對(duì)畜禽廢棄物生物硫處理的研究文獻(xiàn)并不多，李彪等[7]從豬場(chǎng)分離出一株巴氏芽孢桿菌WJ-2，對(duì)H2S的去除率高達(dá)62.5%。魏良[8]分別篩選出了動(dòng)性球菌、短狀桿菌、假單胞菌、木霉菌，并將其進(jìn)行組合發(fā)酵雞糞，H2S的釋放量最高可降低59.9%。以上研究主要集中在工業(yè)用水中硫的脫除研究，而對(duì)畜禽廢棄物中硫的脫除研究較少。本研究選擇以S2-的殘留污染為降解對(duì)象，篩選能夠脫硫的功能微生物，以期為解決畜禽糞污中的硫殘留污染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，磷酸二氫鉀2.0 g/L，氯化銨0.4 g/L，氯化鎂0.2 g/L，硫化鈉10 g/L。分離培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，磷酸二氫鉀2.0 g/L，氯化銨0.4 g/L，氯化鎂0.2 g/L，硫化鈉10 g/L，瓊脂20.0 g/L?；罨囵B(yǎng)基（NB）：蒸餾水1 000 mL，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，調(diào)pH 7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，磷酸二氫鉀2.0 g/L，氯化銨0.4 g/L，氯化鎂0.2 g/L，硫化鈉20 g/L。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑盒、基因組抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；微量生化發(fā)酵管（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.4 主要儀器 PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），雙人凈化工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 樣品采自河南省西華縣某規(guī)模化豬場(chǎng)的厭氧池、好氧池、氧化塘等不同糞污處理池的不同位點(diǎn)、不同深度的固體或液體樣品20份。分別取樣品1 g或1 mL樣品放入9 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中富集48 h。

1.2.2 菌株的分離與純化 無(wú)菌吸取富集液0.2 mL加入到分離培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h。然后取富集液0.2 mL涂于分離培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)到平板上長(zhǎng)出單個(gè)且能夠分辨的菌落。再根據(jù)菌落特征挑取不同的菌落劃線接種于活化培養(yǎng)基進(jìn)行純化。

1.2.3 脫硫菌株的篩選 取純化后的菌液，按5%的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)96 h，將培養(yǎng)液4 500 r/min離心20 min，取上清液采用對(duì)氨基二甲基苯胺分光光度法[9]測(cè)定S2-含量，以不接菌的為對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，最后取平均值，以此定量確定所分離菌株對(duì)脫硫能力的大小，篩選降解能力較強(qiáng)的菌株。菌株對(duì)S2-的降解率=（C0－C）/C0，C0為空白對(duì)照組中S2-濃度；C為試驗(yàn)組中S2-濃度。

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)上述篩選的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌株的顯微形態(tài)。

1.2.5 菌株的生理生化鑒定 無(wú)菌吸取適量菌液加入到微量生化發(fā)酵管中，然后倒置于盛有1 mL滅菌蒸餾水的試管中，置37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察各管顏色變化情況并記錄結(jié)果。

1.2.6 菌株16S rDNA的鑒定 采用細(xì)菌鑒定的16S rDNA通用引物，P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明提取分離菌株的基因組DNA，并以其為模板，PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物（10 mmol/L）分別為1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，MgCl22.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）1μL，模板DNA 0.5μL，超純水38 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，60℃ 50 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。吸取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的序列，利用DNAstar6.0軟件包中的Meglign將所測(cè)定的序列與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的相應(yīng)片段進(jìn)行同源性比較，用MEGA5.0軟件包中的Kimura2-parameter法計(jì)算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建序列進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株的初篩結(jié)果 通過(guò)分離培養(yǎng)基初步獲得14株菌株，菌落形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1 分離菌株菌落形態(tài)特征

2.2 菌株的顯微形態(tài)特征 在顯微鏡下，菌株有的呈短粗桿狀，有的呈長(zhǎng)桿狀，有的呈橢圓狀，有的單個(gè)存在，有的呈鏈狀排列，有的能形成芽孢。部分菌株顯微形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.3 菌株脫硫活性測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)測(cè)得對(duì)照組S2-殘留量為6.51 mg/L。由表2可以看出，14株分離菌對(duì)S2-的去除率為38.16%～86.12%，因此，考慮菌株對(duì)S2-的去除率，確定菌株JFF2和JFF3脫硫效果較好，并作為下一步的研究對(duì)象。

2.4 菌株生理生化鑒定結(jié)果 如表3所示，JFF2和JFF3分別具有不同的生理生化特征，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，其結(jié)果分別基本符合芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌的典型特征。

2.5 菌株16S rDNA的鑒定結(jié)果 分別以菌株JFF2和JFF3基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳。如圖2所示，在約1 500 bp處有一清晰的條帶，與預(yù)期大小一致。

表2 不同菌株處理后污水的S2-含量及去除率

表3 JFF2和JFF3生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.6 序列測(cè)定結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示JFF-2序列長(zhǎng)度為1 450 bp，JFF-3菌序列長(zhǎng)度為1 440 bp。同源性比較結(jié)果可知，JFF-2與地衣芽孢桿菌的同源性較高，其中與Bacillus licheniformisATCC 14580基因序列同源性最高為99.9%，JFF-3與糞產(chǎn)堿桿菌的同源性較高，其中與Alcaligenes faecalisNBRC 13111基因序列同源性最高為98.9%。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果與同源性比較的結(jié)果相似，JFF-2與Bacillus licheniformisATCC 14580處于同一亞支，JFF-3與Alcaligenes faecalisNBRC 13111處于同一亞支（圖3、4），在菌株分類上屬于同一個(gè)種，分別為地衣芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌。

3 討 論

從自然界中生產(chǎn)者、消費(fèi)者、分解者三者循環(huán)存在相生相克的原理分析，在某種物質(zhì)污染的環(huán)境中必然存在能夠降解這種物質(zhì)的微生物。所以本研究分析認(rèn)為豬場(chǎng)糞便中存在硫化物，在其放置的過(guò)程中，必然會(huì)有降解硫化物的微生物的存在[6,10]。本研究從規(guī)?；i場(chǎng)糞污處理的不同環(huán)節(jié)分別取樣進(jìn)行分離，并采用以Na2S為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)的條件下進(jìn)行篩選，事實(shí)也證明，自該種培養(yǎng)基平板挑取的菌落純化后對(duì)Na2S均有不同程度的降解作用，這就大大降低了利用普通培養(yǎng)基盲篩所帶來(lái)的繁雜工作量。同時(shí)也說(shuō)明在不同級(jí)別中均存在降解硫化物的不同種類的微生物，在實(shí)際生產(chǎn)中它們可能起相互協(xié)同作用[11]，所以在單菌株篩選后，要想進(jìn)一步提高降解率，最好選擇不同菌株混合發(fā)酵。

目前已發(fā)現(xiàn)的脫硫微生物有硫桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬等10多個(gè)種屬[11-12]。尚麗勤[13]將篩選出的互補(bǔ)拮抗除臭微生物進(jìn)行菌種復(fù)配，脫硫復(fù)合菌株使H2S平均釋放量比對(duì)照組降低46.26%。周東興等[14]自蚯蚓糞中分離獲得了芽孢桿菌、黃單胞菌和假單胞菌各1株，經(jīng)組合后可使H2S降解率提高71.53%。Hisashi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌可清除污水中99.8%的H2S。所以不同的菌株以及不同的菌株組合對(duì)不同底物中的H2S降解效率不同，因此，要想獲得最佳的降解效果，最好是自降解底物中進(jìn)行分離篩選，這樣篩選的微生物不僅能夠脫硫，而且能夠在含硫的污染物基質(zhì)中快速增殖，有利于提高降解效率。本研究處理對(duì)象是規(guī)?；i場(chǎng)的污水，因?yàn)槲鬯写嬖谟辛蚧锏臍埩?，所以?huì)帶來(lái)H2S的排放污染，也會(huì)氧化污水處理過(guò)程中的金屬設(shè)備，因此規(guī)?；i場(chǎng)的污水中硫的降解對(duì)于豬舍空氣質(zhì)量、環(huán)境保護(hù)及延長(zhǎng)設(shè)備使用壽命等具有重要的意義。本研究從規(guī)?；i場(chǎng)的污水中分離了2株微生物，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌，其對(duì)硫的降解率分別可達(dá)84.02%和86.12%。根據(jù)國(guó)家農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求硫化物≤1mg/L[16]，而本研究所篩選的菌株JFF2處理后污水中的硫化物的殘留量為1.04 mg/L，基本達(dá)到了排放標(biāo)準(zhǔn)，而菌株JFF3處理后污水中的硫化物含量?jī)H為0.9 mg/L，從而完全可達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了豬場(chǎng)污水的安全排放，防止通過(guò)污染的土壤和水導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品、瓜果的殘留，有利于保證人類的食品安全。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從規(guī)模化豬場(chǎng)中分離篩選了2株能夠高效降解硫的細(xì)菌JFF2和JFF3，降解率分別為84.02%和86.12%，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌。