甲基-β-環(huán)糊精載膽固醇對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融后體外成熟及其受精能力的影響

汪秋月，張靖田，羅曉彤，陳 璇，金 一，徐 妲*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.琿春市哈達(dá)門鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林琿春 133309）

配子和胚胎的低溫保存已成為保護(hù)人類和動(dòng)物遺傳物質(zhì)的一種廣泛工具[1]。卵母細(xì)胞冷凍保存及體外培養(yǎng)是一種具有潛在價(jià)值的技術(shù)，但與卵巢組織和整個(gè)胚胎冷凍保存研究相比，卵母細(xì)胞冷凍保存的研究仍然落后[2]。因此，提高卵母細(xì)胞的冷凍保存及胚胎發(fā)育具有很高的研究?jī)r(jià)值。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的低溫保存有2種截然不同的保存方法[3]，即常規(guī)的緩慢冷凍和玻璃化冷凍。緩慢冷凍會(huì)增加細(xì)胞損傷，玻璃化冷凍方法的有效性得以突出[4]。此外，成熟卵母細(xì)胞的低溫保存可能導(dǎo)致透明帶（ZP）硬化進(jìn)而影響受精過程[5]。因此，無論使用任何方法冷凍保存細(xì)胞，單獨(dú)或組合使用冷凍保護(hù)添加劑成為必需。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精能有效調(diào)節(jié)膜膽固醇含量[6]，提高疏水性物質(zhì)的溶解性，因此被視為一種有效的載體體系，甲基-β-環(huán)糊精載膽固醇（CLC）是最有效的環(huán)糊精家族成員。在冷凍保存前，用 CLC 對(duì)幾個(gè)冷休克敏感品種的精子進(jìn)行冷凍處理，可提高精子的冷凍存活率[7]。有研究表明，CLC 進(jìn)入卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞可提高玻璃化成熟牛卵母細(xì)胞的存活率[8]。細(xì)胞凋亡是一種必不可少的細(xì)胞程序，其中 Caspase-3 是一種經(jīng)常被活化的死亡蛋白酶，催化許多關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的特異性切割。Caspase-3 也是細(xì)胞凋亡的一些典型標(biāo)志[9]，對(duì)于所有細(xì)胞類型中的凋亡染色質(zhì)濃縮和DNA片段化是必不可少的。目前關(guān)于CLC對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞凍融體外培養(yǎng)成熟后細(xì)胞凋亡損傷的研究很少。因此，本研究中在玻璃化冷凍液中添加不同濃度冷凍保護(hù)劑CLC，探究CLC對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融后細(xì)胞凋亡表達(dá)，以及探索CLC在豬卵母細(xì)胞成熟、ZP硬化和精子-卵母細(xì)胞結(jié)合中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 豬卵巢取自于延吉市屠宰場(chǎng)；公豬精液取自于延吉市種豬站。

TCM-199、NaHCO3、NaCl、KCl、Hepes、EDTA、PBS、Hoechst33342、Anti-Rabbit IgG、Tris 均購自Sigma 公司；Cleaved Caspase3(Asp175)Antibody 購自CellSignaling。SDS 電泳液、ECL顯色液均購自碧云天生物技術(shù)研究公司。

1.2 主要藥品配置 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：稱取 0.274 8 g葡萄糖、1.053 g NaHCO3、0.05 g丙酮酸鈉、7.5 g TCM-199、0.037 5 g青霉素、0.025 g鏈霉素、0.5 g聚乙烯醇溶于去離子水中定容至 500 mL，于 4℃下存放。玻璃化冷凍液：4.788 g蔗糖于50 mL離心管中，分別加入5.25 mL乙二醇、5.25 mL DMSO、3.5 mL血清、10.25 mL TCM-199，輕輕搖晃至完全溶解后，用 TCM-199 定容至 35 mL晃動(dòng)溶解，-20℃冷凍保存。

1.3 卵丘一卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）的獲取和 GV 期卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍 用 20 mL注射器抽取卵巢上直徑為3～6 mm的卵泡中的卵泡液，將卵泡液注入到 15 mL離心管中置于 38.5℃的水浴鍋中30 min，吸去上清液加入10 mL TCM-washing洗 液，在38.5℃、5% CO2、最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置10 min，重復(fù) 2 遍后挑取COCs，即GV期卵母細(xì)胞。試驗(yàn)分別在玻璃化冷凍保護(hù)液中添加0（對(duì)照組）、0.5、5、10 mg/mL CLC。將挑選好的COCs在平衡液中平衡 5 min，每10枚加入50 μL的冷凍液，然后COCs轉(zhuǎn)移到冷凍管，浸入液氮中進(jìn)行冷凍保存。

1.4 玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞解凍及體外成熟培養(yǎng)（IVM）冷凍2周后取出卵母細(xì)胞，置于解凍溶液中解凍后，再用成熟液將卵母細(xì)胞洗滌2～3次，然后轉(zhuǎn)移到含有10%血清的TCM-199中恢復(fù)1 h?；謴?fù)后用預(yù)平衡的TCM 洗滌液、PBS 緩沖液和IVM溶液洗滌5次，直到卵母細(xì)胞周圍沒有雜質(zhì)。然后將卵母細(xì)胞放置在預(yù)平衡的體外成熟培養(yǎng)小滴中，置于最大飽和濕度為38.5℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。排出第一極體標(biāo)志著卵母細(xì)胞核成熟，即MⅡ期。

1.5 卵母細(xì)胞蛋白提取 分別將150枚成熟卵母細(xì)胞放入離心管中，加入 25 μL NaH2PO4緩沖液，70℃水浴40 min，然后4℃ 6 000 r/min離心2 min，取上清液-80℃待用。

1.6 蛋白免疫印跡（WB）分別取20 μL卵母細(xì)胞蛋白和5×鈉-十二烷基硫酸鹽緩沖液在 100℃水浴8 min，在電壓為100 V 條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。電泳完畢后，4℃電流200 mA電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)到PVDF膜上約40 min，不留有氣泡。轉(zhuǎn)膜后用TBST洗膜3次，每次10 min，室溫將膜用5%牛血清白蛋白（BSA）在Tris緩沖鹽水（TBST）中封閉1 h。加入一抗4℃孵育12 h，棄一抗，TBST洗膜3次。加入二抗，室溫孵育2 h后棄二抗，再次洗膜3次。將ECL染色均勻滴到PVDF膜上，避光出現(xiàn)條帶拍照保存。

1.7 ZP硬化分析 在37℃電熱恒溫板上，將每組10枚成熟卵母細(xì)胞放入0.05 % 的鏈酶蛋白酶80 μL小滴中，在顯微鏡下觀察ZP硬化所需要的時(shí)間，將卵母細(xì)胞置于鏈酶蛋白酶溶液中的時(shí)間與以顯微鏡 200倍的放大倍數(shù)不再可見ZP的時(shí)間間隔為ZP硬化時(shí)間。

1.8 精卵結(jié)合測(cè)定 成熟卵母細(xì)胞在 PVA緩沖液小滴中清洗3次，每 15個(gè)放到1個(gè)獲能小滴中，每個(gè)小滴注入50 μL精液，培養(yǎng)箱中孵育6 h。將受精卵在0.1% PBSPVA液中洗滌 4 次，用戊二醛溶液固定30 min，PVAPBS清洗 3次后，用Hoechst 33342染色10 min。然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)均重復(fù)5次。使用Image J軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)使用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 CLC對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞凍融后體外成熟率的影響由表1可見，0.5 mg/mL CLC處理組和對(duì)照組的卵母細(xì)胞成熟率差異不顯著，5 mg/mL CLC處理組的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于對(duì)照組和0.5 mg/mL CLC處理組，但與10 mg/mL CLC處理組差異不顯著。

表1 CLC對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融后體外成熟率的影響

2.2 CLC對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融體外成熟培養(yǎng)后凋亡蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡分析后，在 17 ku 處出現(xiàn)Cleaved Caspase-3蛋白條帶（圖1-A），灰度值分析結(jié)果顯示（圖1-B），5 mg/mL CLC處理組的Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和0.5 mg/mL CLC處理組，與10 mg/mL CLC處理組沒有顯著差異。

2.3 CLC對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融體外成熟培養(yǎng)后透明帶硬化時(shí)間的影響 由表2可見，5 mg/mL CLC處理組ZP的硬化時(shí)間顯著低于對(duì)照組和0.5、10 mg/mL CLC處理組。

表2 CLC對(duì) GV期豬卵母細(xì)胞凍融體外成熟培養(yǎng)后透明帶硬化時(shí)間的影響 s

2.4 CLC對(duì)GV期豬卵母細(xì)胞凍融體外成熟培養(yǎng)后精-卵母細(xì)胞結(jié)合力的影響 由圖 2 可見，0.5、5、10 mg/mL CLC處理組藍(lán)色熒光數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，亮藍(lán)色即為卵母細(xì)胞上黏附的精子。分析后得出，0.5、5、10 mg/mL CLC處理組精卵結(jié)合率顯著高于對(duì)照組（圖3）。

3 討 論

目前，在各種物種中，冷凍保存的卵母細(xì)胞體外發(fā)育水平仍然很低[10]。其中卵母細(xì)胞質(zhì)量和冷凍保存程序是影響卵母細(xì)胞成活的主要因素。在慢速冷凍過程中，可以形成細(xì)胞周圍的液氮蒸汽并產(chǎn)生絕緣層，隨后導(dǎo)致冷卻速率降低并且可能發(fā)生細(xì)胞結(jié)晶[11]，而卵母細(xì)胞的玻璃化溶液可以確保細(xì)胞被液氮包圍而不是蒸汽包圍。玻璃化冷凍克服了慢速冷凍方法的缺點(diǎn)，適用于卵母細(xì)胞冷凍保存。膽固醇是膜的主要結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)其功能，具有高濃度膽固醇的膜在低溫下更具流動(dòng)性，在冷卻過程中更能抵抗損傷[12]。CLC具有很高的親和力，使用 CLC來改變細(xì)胞膜膽固醇的水平，能提高綿羊[13]、牛[14]和馬[15]對(duì)冷凍保存的耐受性和冷凍存活率。本研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑中添加5 mg/mL CLC顯著提高了卵母細(xì)胞成熟率，說明CLC在豬GV期卵母細(xì)胞的凍存中對(duì)卵母細(xì)胞膜起到了保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞的冷凍損傷起到緩解作用。

凋亡性細(xì)胞死亡是卵泡閉鎖過程中細(xì)胞損失的潛在機(jī)制[16]。在整個(gè)卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞可以通過間隙連接相互連通，這些通道允許轉(zhuǎn)移營養(yǎng)素和調(diào)節(jié)因子。凋亡是由 Caspases介導(dǎo)的，Caspases是半胱氨酸蛋白酶家族的一種，通常以不活躍的酶原的形式存在于健康細(xì)胞中，但當(dāng)受到刺激時(shí)，它們會(huì)經(jīng)歷自溶裂解而變得完全活躍，這可能導(dǎo)致底物的活化、失活、重新定位或重構(gòu)。因此，許多裂解片段在凋亡過程中保持完整，可以使用基質(zhì)特異性抗體檢測(cè)[17]。Caspase在細(xì)胞凋亡過程中負(fù)責(zé)大部分的蛋白水解，所以檢測(cè)裂解的 Cleaved Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞死亡或凋亡死亡的可靠標(biāo)記[18]。本研究中5 mg/mL CLC處理組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低，但與10 mg/mL CLC處理組差異不顯著，需要更進(jìn)一步深入研究。Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量越低說明對(duì)卵母細(xì)胞凋亡損傷越小。

在卵母細(xì)胞成熟過程中，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器經(jīng)歷了各種重塑和再分配過程。在玻璃化冷凍中，細(xì)胞器的皮質(zhì)顆粒受到嚴(yán)重影響，這可能會(huì)損害受精并損害胚胎發(fā)育。ZP是圍繞哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和植入前胚胎的抗遺傳和生化復(fù)合物糖蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[19]。在受精過程中精子必須首先粘附在ZP表面并在它們到達(dá)卵子的質(zhì)膜之前穿透ZP[20]。冷凍可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞ZP硬化[21]。在冷凍保存期間，皮質(zhì)顆粒被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，卵母細(xì)胞可能會(huì)被人工激活[22]，并且在實(shí)際受精之前卵母細(xì)胞的內(nèi)容物會(huì)融入透明帶層，從而誘導(dǎo)ZP硬化。本研究中，在冷凍保護(hù)劑中添加濃度為 5 mg/mL的CLC時(shí)ZP的硬化時(shí)間最短?？梢娫诶鋬鲆褐刑砑舆m宜濃度的 CLC 降低卵母細(xì)胞ZP硬化時(shí)間，可防止多精入卵的情況發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在玻璃化冷凍保護(hù)劑中添加5 mg/mL CLC可以提高凍融后卵母細(xì)胞成熟率，降低體外成熟培養(yǎng)后卵母細(xì)胞Cleaved Caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)量，減少透明帶硬化時(shí)間，提高精-卵結(jié)合能力。可見，CLC緩解了豬卵母細(xì)胞在冷凍解凍過程中由低溫造成的冷凍損傷，提高了卵母細(xì)胞凍融后體外成熟培養(yǎng)水平，為豬卵母細(xì)胞的冷凍保存及體外培養(yǎng)發(fā)育提供了理論依據(jù)。然而，對(duì)于豬卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)還需要更進(jìn)一步研究和提高。