PPARγ與FAS基因在白洗豬及蘇白雜交F1代不同組織中的表達(dá)分析

吳 雨，苑洪霞，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proli ferators-activated Receptorsγ，PPARγ）屬于激素核受體家族，是核激素受體家族中受配體激活的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有3種亞型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控中起重要作用[1]。PPARγ作為脂肪分化的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)影響脂肪酸及其衍生物的生成發(fā)揮調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖和分化功能，不僅能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，增加脂肪細(xì)胞數(shù)量，還可間接影響其他脂肪沉積相關(guān)基因[2]。脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）是體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵酶，最早由Wakil等[3]從鵝肝臟勻漿中發(fā)現(xiàn)，位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，通過(guò)催化乙酰CoA和丙二酰CoA生成長(zhǎng)鏈脂肪酸，屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體與腫瘤壞死因子受體超家族成員[4]。相關(guān)研究表明FAS基因與多種腫瘤的發(fā)生存在密切聯(lián)系[5-6]，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激脂肪酸合成酶異常表達(dá)，從而促使脂肪酸合成[7]。白洗豬是貴州地方優(yōu)良品種，原產(chǎn)于施秉縣白洗鄉(xiāng)（今柳塘鎮(zhèn)），具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，深受當(dāng)?shù)厝罕娤矏?ài)[8]。蘇太豬是利用杜洛克豬和梅山豬及二花臉豬雜交合成而培育的品種，具有繁殖性能高、生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)[9]，在前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)獲得蘇白雜交F1代（SBF1代）。本實(shí)驗(yàn)以白洗豬及SBF1代作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)2個(gè)豬種不同組織中PPARγ與FAS基因mRNA水平的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究白洗豬和SBF1代豬脂肪沉積的調(diào)控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自貴州省白洗豬種質(zhì)資源保護(hù)基地，選取飼養(yǎng)條件相同體重相近的10月齡無(wú)疾病白洗豬和SBF1代，采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌8個(gè)組織樣。包裝編號(hào)，放入液氮罐中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 Trizol、氯仿、異丙醇，均為市購(gòu)；Revert AidTM、FirstStrand cDNA Synthesis、熒光染料UItraSYBR Mixture(With ROX)、DNA Marker1000、2×Taq MasterMix，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取、檢測(cè)及cDNA第一條鏈合成 按照Trizol法提取白洗豬及SBF1代各組織器官中的總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和OD值，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和完整性。根據(jù)Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為40 μL：RNA Template 2 μL（800 ng/μL），Oligo(dT)18Primer 2 μL，RiboLock RNase Inhibitor 2 μL，ReverAid RT 2 μL，10 mmol/L dNTP Mix 4 μL，5×RT Buffer 8 μL，Nucleasefree Water補(bǔ)足至40 μL。反應(yīng)條件：42℃孵育60 min，70℃孵育5 min。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（cDNA置于-20℃冰箱保存）。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的豬（Sus scrofa）PPARγ基因（NM：214379.1）和FAS基因（NC_010456.4）mRNA序列設(shè)計(jì)引物，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH）基因作為qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參基因。運(yùn)用Primer Premier5.0在線軟件設(shè)計(jì)特異性熒光引物（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR Green熒光染料法在熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。反應(yīng)體系為10 μL：2×UItraSYBR Mixture 5.8 μL，PrimerSense 0.6 μL，Primer Anti-sense 0.6 μL，cDNA模板 2 μL（800 ng/μL），ddH2O 1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 13s，58℃28s，循環(huán)45次后進(jìn)行溶解曲線分析，以每5 s上升0.5℃的速率從60℃升高到95℃，每個(gè)樣品檢測(cè)做3個(gè)重復(fù)，取平均值。

表1 熒光定量引物信息

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)不同基因在組織中的表達(dá)按照2-△△Ct法計(jì)算。目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，其中△△Ct=（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-（各組織Ct值-對(duì)照組織Ct值），用Spss18.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1PPARγ、FAS基因在各組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 由圖1可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮、清晰且未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線 擴(kuò)增結(jié)果顯示，在各組織器官中PPARγ、FAS基因擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，曲線平滑未出現(xiàn)特殊趨勢(shì)。溶解曲線均呈單峰，峰值較好，無(wú)引物二聚體，無(wú)雜峰，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求（圖2、圖3）。

2.3 白洗豬及SBF1代豬不同組織中PPARγ基因mRNA表達(dá)分析 由圖4可知，PPARγ基因在白洗豬和SBF1代豬8個(gè)組織中均有表達(dá)，白洗豬PPARγ基因表達(dá)趨勢(shì)依次為皮下脂肪＞肝＞脾＞腎＞肺＞心＞胃＞背最長(zhǎng)肌，其中，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織，其他7個(gè)組織器官之間表達(dá)差異不顯著。PPARγ基因表達(dá)量在SBF1代豬中表達(dá)趨勢(shì)為皮下脂肪＞肝＞脾＞肺＞腎＞胃＞背最長(zhǎng)?。拘?，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織，其余的組織器官之間表達(dá)差異不顯著。比較白洗豬和SBF1代豬同一組織中PPARγ基因表達(dá)量，顯示白洗豬的皮下脂肪組織表達(dá)顯著高于SBF1代豬，其余組織表達(dá)不顯著。

2.4 白洗豬及SBF1代豬不同組織中FAS基因mRNA表達(dá)分析 由圖5可知，F(xiàn)AS基因在白洗豬和SBF1代豬的8個(gè)組織中均有表達(dá)，白洗豬FAS基因表達(dá)量依次為皮下脂肪＞腎＞肝＞脾＞肺＞背最長(zhǎng)?。疚福拘?，其中，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織，其他7個(gè)組織器官之間表達(dá)差異不顯著。FAS基因表達(dá)量在SBF1代豬中高低順序?yàn)槠は轮荆靖危酒ⅲ颈匙铋L(zhǎng)肌＞腎＞胃＞肺＞心，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織，其余的組織器官之間表達(dá)差異不顯著。比較白洗豬和SBF1代豬同一組織中FAS基因表達(dá)量，顯示FAS基因在2個(gè)豬種的皮下脂肪組織表達(dá)量達(dá)到差異顯著水平，SBF1代豬的皮下脂肪組織表達(dá)量高于白洗豬，其余表達(dá)不顯著。

3 討 論

有關(guān)研究表明，PPARγ處于脂肪細(xì)胞分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心位置[10]，對(duì)脂肪細(xì)胞早期分化起到不可或缺的作用。研究表明在成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PPARγ可以促使其向脂肪細(xì)胞分化[11]，在脂肪分化沉積過(guò)程中，PPARγ與CCAATT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α通過(guò)相互正反饋調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)脂肪分化與脂質(zhì)沉積[12]，尚未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以在PPARγ缺失的情況下向脂肪細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)以PPARγ為研究對(duì)象，對(duì)白洗豬和SBF1代的8個(gè)組織PPARγ基因mRNA進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與PPARγ基因mRNA在肉牛[13]、肉雞[14]和八眉豬[15]中結(jié)果一致，說(shuō)明PPARγ對(duì)不同物種的脂肪沉積都具有重要作用，且表達(dá)特異性趨于一致。本研究發(fā)現(xiàn)PPARγ基因白洗豬皮下脂肪組織的表達(dá)量顯著高于SBF1代，推測(cè)PPARγ基因更有利于白洗豬的脂肪沉積。

FAS在哺乳動(dòng)物脂肪、肝臟、腎臟、肺臟等組織及細(xì)胞中均有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)探究了FAS基因在白洗豬和SBF1代豬8個(gè)不同組織中的表達(dá)，結(jié)果與陳妍[16]對(duì)八眉豬、馬麗[17]對(duì)馬身豬和大白豬的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AS基因在白洗豬皮下脂肪組織的表達(dá)量顯著低于SBF1代，推測(cè)FAS基因?qū)BF1的脂肪沉積效果更顯著。

綜上，PPARγ基因和FAS基因在2個(gè)豬種的皮下脂肪中均高表達(dá)，且與其他組織差異極顯著，在白洗豬皮下脂肪組織中，PPARγ基因表達(dá)量高于FAS基因，在SBF1代豬皮下脂肪組織中，F(xiàn)AS基因表達(dá)量高于PPARγ基因，說(shuō)明PPARγ基因和FAS基因都能促進(jìn)白洗豬和SBF1代豬的脂肪沉積，但作用效果不同。推測(cè)PPARγ基因?qū)Π紫簇i脂肪沉積作用更大，而在SBF1代豬中FAS基因作用更顯著，故2個(gè)基因均可為影響白洗豬和SBF1代豬脂肪沉積的候選基因。