維生素C聯(lián)合替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制*

陳明生， 趙?？?， 程瑩瑩， 袁致海， 張?jiān)搅?/p>

(1. 西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 陜西省腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710038； 2. 西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 西安 710038； 3. 西安醫(yī)學(xué)院陜西省腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，40%的惡性膠質(zhì)瘤患者生存期低于1年[1-3]。膠質(zhì)瘤的高侵襲性導(dǎo)致其高復(fù)發(fā)率[4-5]。替莫唑胺作為新型的膠質(zhì)瘤主要化療藥物，能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦脊液，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持有效的需要濃度[6]，從而有效的抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，提高了患者的生存期。但是替莫唑胺的作用仍不是完全有效的[7,8]。因此，找到更敏感的化療藥物成為膠質(zhì)瘤治療中重要的研究方向。維生素C(VC)是一種水溶性的維生素及輔酶。近年來(lái)，VC被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用[9-11]。有研究報(bào)道，VC可協(xié)同化療藥物，如灰樹(shù)花多糖(maitake polysaccharide, MP)、三氧化二砷及吉西他濱(Gemcitabine)抑制腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌及胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。并且VC及甲萘醌(Menadione，VitaminK3)聯(lián)合使用被認(rèn)為可以協(xié)同介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的死亡[12]，但VC與替莫唑胺的協(xié)同作用及其機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)中以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞BMG-1及SHG44為研究對(duì)象，旨在探討VC聯(lián)合替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的毒性作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

膠質(zhì)瘤細(xì)胞BMG-1購(gòu)自于印度班加羅爾；SHG44細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司，中國(guó))；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清、青鏈霉素、胰酶(Sigma公司，美國(guó))；ERK抑制劑U1026、替莫唑胺(MCE公司，美國(guó))；維生素C(上海生工公司，中國(guó))；替莫唑胺(MCE中國(guó)，中國(guó))細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性試劑盒(碧云天，中國(guó))；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天，中國(guó))；U0126(MEK1/2抑制劑)(碧云天，中國(guó))。普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；自動(dòng)酶標(biāo)儀(Elx800)(Bio-rad，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Microm，德國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

膠質(zhì)瘤細(xì)胞BMG-1、SHG44細(xì)胞采用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中。

將BMG-1及SHG44細(xì)胞分別分為：(1)對(duì)照組：不進(jìn)行處理；(2)TMZ組：采用0.20 mmol/L TMZ處理細(xì)胞；(3)VC+TMZ組，分別采用0,0.25,0.50,0.75,1.00 mmol/L VC與0.20 mmol/L TMZ共同處理細(xì)胞；(4)TMZ+U0126組，采用0.2 mmol/L TMZ與10 μmol/L U0126共同處理細(xì)胞。

1.3 用MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種96孔板中，每孔2×103cells，每組3個(gè)復(fù)孔。24 h后，加入50 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入200 μl DMSO，檢測(cè)吸光度值(OD值)，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 用細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種96孔板中，每孔2×103cells，采用流式細(xì)胞儀，按照細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說(shuō)明，對(duì)各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)，采用BD FACSDiva軟件采集結(jié)果，分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2遍后，采用RIPA裂解提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。配制10% SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，一抗(1∶1 000)振蕩孵育4℃過(guò)夜，之后加入山羊抗兔或大鼠二抗(1∶2 000)，室溫振蕩孵育1 h，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.6 用ROS試劑盒檢測(cè)活性氧水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種96孔板中，每孔2×103cells，培養(yǎng)24 h。按照分組處理細(xì)胞后，每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37℃避光反應(yīng)20 min后吸去探針，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，隨后用胰酶消化細(xì)胞，離心除去上清液，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定活細(xì)胞的ROS相對(duì)強(qiáng)度。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 VC聯(lián)合TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響

將不同濃度的VC (0, 0.25, 0.50, 0.75及 1.00 mmol/L)及0.20 mmol/L TMZ共處理BMG-1及SHG44細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度VC聯(lián)合TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤存活率的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，TMZ組膠質(zhì)瘤細(xì)胞(BMG-1及SHG44細(xì)胞)的存活率顯著下降(P<0.05)；與TMZ組相比較，VC+TMZ組膠質(zhì)瘤細(xì)胞(BMG-1及SHG44細(xì)胞)的存活率顯著下降(P<0.05，表1)。從表1可見(jiàn)，當(dāng)VC 0.5 mM聯(lián)合TMZ 0.2 mmol/L時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率已顯著下降(P<0.01)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，均觀察VC 0.5 mmol/L聯(lián)合TMZ 0.2 mmol/L對(duì)不同指標(biāo)的影響。

Tab. 1 Effects of VC on the survival rate in the BMG-1 and SHG44 cells(%， n=3)

用0.50 mmol/L VC及0.20 mmol/L TMZ共處理細(xì)胞0、24、48及72 h的結(jié)果顯示，24～72 h內(nèi)，與對(duì)照組相比較， TMZ組及VC+TMZ組細(xì)胞生存率降低，且VC+TMZ組生存率顯著低于TMZ組(P<0.01，表2)。上述結(jié)果均說(shuō)明VC能增強(qiáng)TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤的毒性。

Tab. 2 Effects of VC on the survival rate combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells(OD, n=3)

2.2 VC聯(lián)合TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組相比較，TMZ組的細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；與TMZ組比較， VC+ TMZ共同處理可增加膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡(P<0.01，表3)。同時(shí)，Bax, Cleaved caspase-3及Cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01,圖1，表3)。

Fig. 1 Effects of VC on the relative expressions of the proteins combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells by western blot (n=3)

Tab. 3 Rates of apoptosis and relative expressions of protein in cells by flow cytometry and Western n=3)

2.3 VC聯(lián)合TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS水平的影響

與對(duì)照組相比較，TMZ組膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS水平顯著增加(P<0.01)。而與TMZ組比較，VC+TMZ組ROS水平顯著降低(P<0.01，表4)。

Tab. 4 Effects of VC on the relative expression of ROS combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells by flow cytometry (A.U.， n=3)

2.4 VC聯(lián)合TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組相比較，TMZ組自噬蛋白LC3-II/LC3-I表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)而p62表達(dá)降低(P<0.01)。與TMZ組對(duì)比，VC+TMZ組中自噬蛋白LC3-II/LC3-1表達(dá)降低，在SHG44細(xì)胞中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是在BMG-1細(xì)胞中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而p62表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖2，表5)。

Fig. 2 Effects of VC on cell autophagy combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells by Western blot (n=3)

Tab. 5 Effects of VC on the relative expression of LC3-II/LC3-I and p62 combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells by Western blot n=3)

2.5 VC聯(lián)合TMZ通過(guò)ERK信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比較，TMZ組中p-ERK1/2表達(dá)增加(P<0.01)，t-ERK1/2表達(dá)變化不大，LC3-II/LC3-I表達(dá)增加(P<0.01)，Cleaved caspase-3、Cleaved PARP表達(dá)增加(P<0.05)。與TMZ組相比較，VC+TMZ組和TMZ+U0126組p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，t-ERK1/2表達(dá)變化不大，LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著降低，Cleaved caspase-3、Cleaved PARP表達(dá)顯著增加(P<0.05，圖3，表6)。

Fig. 3 Effects of VC on the relative protein expressions combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells by Western blot (n=3)

Tab. 6 Effects of VC on the relative protein expressions combined with TMZ in the BMG-1 and SHG44 cells n=3)

2.6 VC聯(lián)合TMZ通過(guò)ERK信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-FITC/PI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，TMZ組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)。與TMZ組相比較，VC+TMZ組和TMZ+U0126組中細(xì)胞凋亡率增加(P< 0.01，表7)。

Tab. 7 Effects of VC on the apoptosis combined with TMZ through ERK signaling pathway in the BMG-1 and SHG44 cells (%， n=3)

3 討論

膠質(zhì)瘤目前的主要治療方法是手術(shù)切除合并放化療，但這種療法效果并不令人滿意，膠質(zhì)瘤仍是復(fù)發(fā)率高致死率高的腦腫瘤[13,14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TMZ可以有效緩解患者的癥狀，并降低腫瘤負(fù)荷[8,15]。聯(lián)合應(yīng)用傳統(tǒng)化療藥物或分子治療藥物及TMZ具有協(xié)同作用，且藥物耐受度高[16,17]。另外，有研究報(bào)道VC聯(lián)合化療藥物使用，具有抗腫瘤作用[9-11]。但是VC在膠質(zhì)瘤化療中作用的機(jī)制尚不明確。因此，本研究聯(lián)合VC及TMZ作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞BMG-1及SHG44，來(lái)檢測(cè)VC在TMZ細(xì)胞毒性中的作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道VC在很多腫瘤細(xì)胞，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中具有選擇性的毒性作用[18]。VC可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的程序性死亡[19]。已知VC抗腫瘤作用的機(jī)制包括：(1)VC選擇性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA氧化應(yīng)激損傷同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞外H2O2，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。(2)VC影響B(tài)cl-2及Bax表達(dá)，通過(guò)降低Bcl-2/Bax比率，從而減低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性并促進(jìn)凋亡。有研究報(bào)道，VC介導(dǎo)的凋亡與Caspase-3相關(guān)[20]。Rodriguez等人發(fā)現(xiàn)VC抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖[21]。本實(shí)驗(yàn)首次探討TMZ與VC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率及凋亡率，并檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示VC能增強(qiáng)TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤的毒性，包括抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡，并抑制TMZ誘導(dǎo)的自噬作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)VC可通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)ROS抑制劑水平介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[22]。ROS可促進(jìn)DNA氧化應(yīng)激損傷，DNA完整性破壞，基因突變率增高，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[23, 24]。研究表明，VC可介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞自噬及ATP消耗，干擾細(xì)胞周期，從而形成對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[25]。本實(shí)驗(yàn)采用DCFH-DA染色及Western Blot法檢測(cè)ROS水平及自噬的結(jié)果顯示，在BMG-1及SHG44細(xì)胞中，VC可以抑制TMZ介導(dǎo)的ROS水平以及自噬。

有文獻(xiàn)報(bào)道，VC可通過(guò)抑制ERK1/2磷酸化來(lái)抑制自噬，ERK同時(shí)可通過(guò)促進(jìn)PKM2磷酸化抑制凋亡[26]。而TMZ介導(dǎo)的ROS可導(dǎo)致ERK磷酸化并促進(jìn)自噬，提示ROS/ERK通路在膠質(zhì)瘤TMZ治療中起重要作用[27]。本研究通過(guò)檢測(cè)ERK通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2和 t-ERK1/2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TMZ升高BMG-1及SHG44細(xì)胞中p-ERK1/2蛋白表達(dá)，而增大VC濃度可降低p-ERK1/2表達(dá)。加入ERK抑制劑U1026后，Cleavedcaspase-3及Cleaved-PARP表達(dá)增加，而LC3-II/LC3-1表達(dá)減低。該結(jié)果提示VC通過(guò)ERK通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制自噬。

綜上所述，VC聯(lián)合TMZ可增強(qiáng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性及凋亡作用，同時(shí)降低ROS水平，通過(guò)ERK信號(hào)通路抑制TMZ介導(dǎo)的自噬。該結(jié)果為VC在膠質(zhì)瘤治療藥物的研究提供新的思路。然而，由于本研究的局限性，需要進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VC與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，為其在膠質(zhì)瘤治療提供更多的證據(jù)。