即早基因c-fos在THP-1單核巨噬細胞亞型極化中的差異表達*

陳啟文， 吳國棟， 顏治云， 張文成， 張 梅

(1. 天津中醫(yī)藥大學研究生院， 天津 301617； 2. 武警后勤學院， 天津 300309； 3. 天津市肝臟胰腺纖維化與分子診療實驗室， 天津 300162； 4. 武警特色醫(yī)學中心心內科， 天津 300162)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CHD)作為危害人群健康的重要疾病之一，近年來呈現(xiàn)出發(fā)病率和死亡率逐年上升的趨勢，并已經成為引起我國國民死亡的主要原因之一[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為CHD的核心病理基礎之一，很長時間以來一直受到多方學者的關注與研究。現(xiàn)有研究仍無法完全闡明AS的發(fā)病機制，主流學說認為，AS病理起源于血管內皮細胞的損傷，繼而出現(xiàn)大量脂質聚集并沉積于內皮下，形成血管內脂質斑塊，隨著病程的進展，脂質斑塊進一步增大阻塞血管可誘發(fā)組織器官缺血性損傷，最終引起一系列包括心腦血管在內的臨床疾病發(fā)生[2]。近年來，基于病理學基礎的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞，在AS的發(fā)生中具有關鍵的作用[3,4]。其兼有對炎性損傷及組織修復的雙向調節(jié)能力，使得其一定程度上左右著AS的發(fā)生和發(fā)展。具體而言，經典活化型巨噬細胞(M1型)具有誘導炎性反應發(fā)生、引發(fā)炎性細胞聚集及促使泡沫細胞形成等作用；而選擇性活化型巨噬細胞(M2型)則具有顯著的抗炎作用，并可通過胞葬作用清除壞死細胞殘體，從而發(fā)揮組織修復作用。在AS斑塊中，M1型巨噬細胞增多可以顯著增加臨床中CHD的發(fā)病率和死亡率；而斑塊內M2型巨噬細胞的增加則可一定程度的穩(wěn)定和修復斑塊，緩解甚至于逆轉AS的發(fā)生和發(fā)展[3,5]。因此，如何有效調節(jié)巨噬細胞的亞型分化對于AS的斑塊形成具有重要的臨床研究價值。

原癌基因c-fos是即早基因(immediate early genes，IEGs)家族中的一員，其與另一IEGs成員c-jun共同組成了AP-1轉錄因子并參與機體細胞功能的多種信號調節(jié)中[6]。不僅如此，尚有研究證實，c-fos還具有獨立的非基因組效應功能，能夠參與如脂質代謝等相關的細胞功能活動中[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在單核細胞向巨噬細胞的分化過程中可通過上調c-fos與c-jun的表達[8]，促進巨噬細胞相關功能基因的轉錄及翻譯，從而調節(jié)單核細胞向巨噬細胞的分化過程，表明c-fos在單核細胞向巨噬細胞的分化中具有重要作用，但對其是否參與巨噬細胞的亞型極化作用仍鮮有報道。因此，本實驗旨在探討c-fos作為單核細胞向巨噬細胞分化的重要調節(jié)因子，是否在巨噬細胞亞型分化中發(fā)揮作用，為研究調節(jié)巨噬細胞的亞型分化，靶向干預巨噬細胞對AS斑塊的穩(wěn)定和修復，抑制斑塊的破裂等提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用人單核細胞白血病細胞株(THP-1)作為研究對象。細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American type culture collection, ATCC)。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；佛波脂(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)購自德國Sigma公司；CD274抗體、CD86抗體、CD163抗體購自萬類生物有限公司；GAPDH抗體和c-fos抗體購自武漢Proteintech公司；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 THP-1單核細胞培養(yǎng)

將凍存的THP-1細胞置于40℃恒溫水浴鍋快速解凍，而后將細胞懸液移置15 ml無菌離心管，并按1∶9比例與RPMI 1640培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液)混勻，水平離心機離心獲得細胞沉淀，以4 ml含血清的培養(yǎng)基重懸后移入培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2孵箱內孵育24 h，并定期觀察細胞狀態(tài)及細胞密度，待鏡下觀察THP-1細胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時進行細胞換液傳代、實驗鋪板及細胞保種等。

1.3 MTT法檢測細胞活性

取對數(shù)期生長良好的THP-1細胞接種于96孔板，每孔加入含血清的細胞懸液100 μl，細胞數(shù)約2×104cells/well，空白孔用無血清培養(yǎng)基填充。將PMA按預設濃度劑量加入各孔，使得終濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml，同時設置零孔，并設3復孔。將細胞置于37℃、5% CO2孵箱內培養(yǎng)6 h，隨后往各孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，置于37℃、5% CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去孔內培養(yǎng)液。向各孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩0.5 min，使結晶物充分溶解。酶標儀OD 560 nm處測量各孔的吸光值。

1.4 實時定量PCR檢測基因表達

運用Trizol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測260 nm～280 nm處OD值，以確定核酸的純度及濃度。所提總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模版擴增c-fos、CD274、CD86、CD163，并以GAPDH作為內參照，采用相對定量法計算獲得結果，引物序列見表1所示。相對表達量=2-ΔΔCT，ΔΔCt=(Ct目的基因(待測樣品)-Ct內參照(待測樣品))-(Ct目的基因(校正樣品)-Ct內參照(校正樣品))。各引物序列均由上海生工生物技術有限公司合成(表1)。

Tab. 1 Primer sequences formation

1.5 免疫蛋白印跡檢測蛋白表達

收集PMA、LPS及IL-4刺激構建的模型細胞，提取各組總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。加入5×SDS上樣緩沖液變性蛋白，加樣，SDS-PAGE凝膠垂直電泳后，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別以anti-c-fos、anti-CD274、anti-CD86、anti-CD163和anti-GAPDH抗體進行抗原抗體結合，4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯影。凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集和分析，GAPDH蛋白條帶作為內參照，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度的百分比值作為目的蛋白表達的相對水平。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 PMA對單核細胞向巨噬細胞分化的影響

相關文獻報道，T淋巴細胞激活劑PMA可在體外誘導人單核細胞分化為早期巨噬細胞[8,9]，因此，實驗起始，首先探索了PMA誘導單核細胞分化的最佳溶度。采用MTT法檢測不同藥物濃度變化對單核細胞分化過程中細胞活性的影響。結果顯示，25 ng/ml的PMA即可誘導懸浮的THP-1單核細胞分化為貼壁的巨噬細胞(圖1)。隨著藥物濃度增加，藥物毒性逐漸增強，當藥物濃度超過100 ng/ml時，大量單核細胞死亡并懸浮于培養(yǎng)基中(表2)，更換培養(yǎng)基后，鏡下觀察可見貼壁的巨噬細胞顯著減少，表明PMA藥物濃度能夠影響實驗細胞活性。因此，我們選取25 ng/ml作為PMA的最適誘導濃度。

Fig. 1 The optimal concentration of PMA-induced differentiation of THP-1 monocytes into macrophages. THP-1cells were incubated with different concentrations of PMA (0, 25, 50, 100 200, 400 ng/ml) for 6 h

Tab. 2 Effect of different concentrations of PMA on cell

2.2 PMA誘導 THP-1單核細胞分化過程中c-fos表達變化

為觀察c-fos在模型中的變化，檢測了PMA誘導THP-1單核細胞分化過程中，c-fos的表達。當PMA刺激在1 h時即可在mRNA水平觀察到c-fos的表達上調，并在6 h達到峰值(表3)。而蛋白水平結果較mRNA稍滯后，在3 h時監(jiān)測到c-fos表達顯著上調，并在12 h達到峰值(圖2)。該結果提示，c-fos在PMA誘導THP-1單核細胞向巨噬細胞分化的過程中表達上調，其可能在單核細胞向巨噬細胞分化中發(fā)揮作用。

Fig. 2 PMA-induced protein expression of c-fos. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for different time intervals (0, 1, 3, 6, 12, 24 h)

Tab. 3 PMA-induced mRNA and protein expression levels of c-fos at different times n=3)

2.3 LPS誘導巨噬細胞向M1型極化過程中c-fos的表達變化

為了進一步研究c-fos是否參與巨噬細胞極化過程，在PMA誘導THP-1單核細胞向巨噬細胞分化的基礎上，探討c-fos在巨噬細胞亞型分化中的表達變化。參閱相關文獻資料，在PMA誘導的基礎上，選取了1 μg/ml的LPS作為刺激濃度[10]，誘導THP-1巨噬細胞向M1型巨噬細胞亞型分化，并運用實時定量PCR技術及Western blot技術檢測M1型特異性標記物的表達以驗證細胞的極化模型。其中，CD86被認為是M1型巨噬細胞的特異性標記物，而CD163及CD274則被認為在M2型巨噬細胞中表達[3]。結果顯示，LPS刺激24 h能夠顯著上調M1型特異性標記物CD86蛋白的表達，并抑制了M2型特異性標記物CD163蛋白表達，而CD274在LPS刺激24 h時表現(xiàn)出蛋白表達的降低(圖3A和表4)。該結果表明，LPS能夠有效誘導了THP-1巨噬細胞向M1型極化。

Tab. 4 LPS-induced protein expression levels of CD274, CD86 and CD163 in THP-1 cells n=3)

隨后，檢測了該極化過程中，c-fos的mRNA和蛋白的動態(tài)變化。結果顯示，LPS刺激在早期即表現(xiàn)出對c-fos的抑制作用，其蛋白和mRNA水平均顯著降低，而后隨著刺激時間延長，c-fos的mRNA表達水平逐漸恢復(表5)，而LPS對c-fos的蛋白表達抑制時間更長，超過了24 h(圖3B)。該結果提示，LPS誘導THP-1巨噬細胞向M1型極化的過程中可抑制c-fos的表達。

Fig. 3 LPS-induced protein expressions of c-fos, CD274, CD86 and CD163. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for 6 h and stimulated with LPS (1 μg/ml) for 24 h after changed medium

Tab. 5 LPS-induced protein and mRNA expression levels of c-fos in THP-1 cells at different times n=3)

2.4 IL-4誘導巨噬細胞向M2型極化過程中c-fos的表達變化

進一步，為了觀察c-fos是否在M2型巨噬細胞的極化過程中發(fā)揮作用，我們在PMA刺激構建THP-1巨噬細胞的基礎上，運用IL-4(10 ng/ml)[11]誘導THP-1細胞極化為M2型巨噬細胞，并分析了亞型特異性標記物的表達變化。結果顯示，IL-4刺激THP-1巨噬細胞24 h后，M2型特異性標記物CD274的蛋白表達升高，CD163同樣表現(xiàn)出蛋白水平上調的趨勢，而M1型巨噬細胞特異性標記物CD86的蛋白表達降低明顯，該結果表明IL-4刺激可誘導THP-1巨噬細胞向M2型極化(圖4A，表6)。之后，動態(tài)觀察c-fos在該過程的表達變化，我們發(fā)現(xiàn)，隨著IL-4刺激時間延長，c-fos在THP-1巨噬細胞中表現(xiàn)出mRNA和蛋白表達顯著上調，并在6h達到峰值(圖4B，表7)。該結果提示IL-4在誘導THP-1巨噬細胞向M2型極化的過程中可上調c-fos的mRNA和蛋白表達。

Fig. 4 IL-4-induced protein expressions of c-fos, CD274, CD86 and CD163. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for 6 h and stimulated with IL-4 (10 ng/ml) for 24 h after changed medium

Tab. 6 IL-4-induced protein expression levels of CD274, CD86 and CD163 in THP-1 cells n=3)

Tab. 7 IL-4-induced protein and mRNA expression levels of c-fos at different times n=3)

3 討論

巨噬細胞表現(xiàn)出亞型和功能的多樣性使得其在AS的病變過程中即充當推動者的作用，又能表現(xiàn)出保護和修復的作用，具有及其復雜的功能調節(jié)機制[12]。新進的多項研究聚焦于巨噬細胞的亞型極化及其功能的表達，并取得一定成果。如Ganta等人的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-93可通過調控干擾素調節(jié)因子-9及其下游通路的表達，促進M2型巨噬細胞極化，從而使缺血肌肉血運重建[13]；Chen HH等人的實驗則發(fā)現(xiàn)，干擾素調節(jié)因子2結合蛋白2(interferon regulatory factor 2-binding protein 2，IRF2BP2)可通過抑制巨噬細胞向M1型極化，減少巨噬細胞引發(fā)的炎癥反應，并可降低AS的易感性[14]。表明調節(jié)亞型極化對于AS及其引起的CHD等相關疾病具有重要的臨床價值。

c-fos作為AP-1調節(jié)因子重要的組成部分，是細胞功能調節(jié)的重要因子之一。其作為即早基因，在受到相關刺激調控后即可快速表達，并通過調節(jié)下游相關基因的轉錄和翻譯，調控細胞的生長、發(fā)育和分化等功能[7,15,16]。既往研究已經證實，c-fos在機體單核細胞向巨噬細胞的分化的過程中與c-jun共同表達并參與細胞分化調節(jié)，但在巨噬細胞亞型分化中是否有作用鮮有報道。因此，本實驗旨在觀察c-fos在巨噬細胞亞型極化中的表達變化，探究c-fos是否在巨噬細胞亞型極化中也發(fā)揮作用。本文結果顯示，c-fos在PMA誘導THP-1單核細胞向巨噬細胞分化的過程中表現(xiàn)出顯著上調的趨勢，說明c-fos在單核細胞向巨噬細胞分化的過程中即以發(fā)揮相關的調節(jié)作用，這與既往的研究結果相同。隨后，本實驗參考既往研究的方法，選取LPS(1 μg/ml)及IL-4(10 ng/ml)作為藥物刺激，誘導THP-1巨噬細胞向M1型或M2型極化，并觀察c-fos在該過程中的表達變化。結果顯示，c-fos在LPS誘導巨噬細胞向M1型極化的過程中表達顯著降低，其蛋白抑制時長甚至超過了24 h；而在IL-4刺激誘導巨噬細胞向M2型極化的過程中，c-fos表達顯著升高。運用實時定量PCR及Western blot技術對細胞亞型標記物進行分析的結果顯示，LPS誘導巨噬細胞極化表現(xiàn)出與M1亞型相關的CD86表達上調和M2亞型相關的CD163、CD274表達降低，表明LPS刺激有效誘導了THP-1巨噬細胞向M1亞型極化；反之，IL-4刺激后，細胞則表現(xiàn)CD163、CD274的上調和CD86的降低，表明IL-4刺激誘導了THP-1巨噬細胞向M2亞型極化的過程。綜合上述結果，推測c-fos很可能在巨噬細胞的亞型極化中發(fā)揮著重要作用，其在M1型極化中表達降低，在M2型極化中的升高可能預示著c-fos具有調節(jié)并促進M2型形成，抑制巨噬細胞向M1型極化的作用。

綜上所述，本實驗結果表明c-fos在巨噬細胞亞型分化中的差異表達，并推測c-fos在不同亞型極化中可能具有相反的作用。這很有可能成為巨噬細胞的亞型及功能調節(jié)的一個新作用靶點，值得更進一步的深入研究。由于巨噬細胞亞型功能在AS中表現(xiàn)出的雙向調節(jié)作用，因此巨噬細胞亞型極化在AS及其相關疾病的臨床預防和治療中具有較好的前景。