食品中阪崎克羅諾桿菌的藥物敏感性及分子分型研究

張彩霞, 陳穎, 胡安妥, 王娉*, 王宏勛

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 武漢 430023; 2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心, 北京 100176; 3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 南京 210046)

克羅諾桿菌(Cronobacter)[原阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)]主要寄生于人體和動(dòng)物腸道內(nèi)，是周生鞭毛、可運(yùn)動(dòng)、無芽孢、兼性厭氧的革蘭氏陰性腸桿菌[1]，在自然界中廣泛分布，乳制品及原料、即食食品、蔬菜、調(diào)味品、乳品生產(chǎn)環(huán)境、沖調(diào)器具等都有檢出克羅諾桿菌的報(bào)道[2]。2012年，Joseph等[3]將克羅諾桿菌屬定義為7個(gè)種，即阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌(Cronobactermalonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacterturicensis)、康帝蒙提克羅諾桿菌(Cronobactercondimenti)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacteruniversalis)、穆汀斯克羅諾桿菌(Cronobactermuytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacterdublinensis)。受到污染的嬰幼兒配方粉是新生兒感染的主要渠道，可導(dǎo)致新生兒腦膜炎、敗血癥和致死性小腸結(jié)腸炎等嚴(yán)重疾病，致死率達(dá)40%～80%[4]。我國(guó)GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》中規(guī)定0～6月齡嬰兒食用的配方食品中不得檢出克羅諾桿菌[5]，此標(biāo)準(zhǔn)與EC 1441/2007[6]中的相關(guān)規(guī)定一致。

克羅諾桿菌具有很強(qiáng)的抗干燥特性[7]，可在低水分活度的嬰幼兒配方食品中長(zhǎng)期存活[8]。乳制品生產(chǎn)加工過程中，如操作不當(dāng)極易造成克羅諾桿菌的污染。近年來，我國(guó)嬰幼兒感染克羅諾桿菌的事件屢有報(bào)道[9-10]。臨床上常使用β-內(nèi)酰胺類抗生素和氨基糖苷類抗生素治療克羅諾桿菌的感染，并且已有相關(guān)耐藥菌株的報(bào)道。周顯鳳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒配方奶粉中分離的7株阪崎腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素均有不同程度的耐藥性，其中1株阪崎腸桿菌幾乎對(duì)被測(cè)的所有頭孢類抗生素耐藥；張西萌等[12]的研究表明，進(jìn)口乳制品中阪崎克羅諾桿菌對(duì)苯唑西林100%耐藥，對(duì)頭孢噻吩、氨芐西林、頭孢唑啉和四環(huán)素具有不同程度的耐藥性；鄭金華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒食品中分離的7株克羅諾桿菌對(duì)頭孢西丁的耐藥率為100%。因此，需要加強(qiáng)嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌的監(jiān)測(cè)及控制污染，其中，對(duì)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)是監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容。本研究分析了食品中分離的68株阪崎克羅諾桿菌的抗生素敏感性和分子分型，探究了阪崎克羅諾桿菌的耐藥情況和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分子分型特征，并探討了二者之間的相關(guān)性，以期為克羅諾桿菌引發(fā)的食源性疾病溯源和分子流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株 從黑龍江、新疆、遼寧、北京等地食品樣品中分離的68株阪崎克羅諾桿菌。其中，58株分離自配方粉，3株分離自巧克力，2株分離自洋蔥圈，2株分離自方便面，1株分離自辣蝦條，1株分離自餅干，1株分離自辣味蝦。所有菌株經(jīng)生化及16s rRNA鑒定確定為阪崎克羅諾桿菌。沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812、質(zhì)控菌株ATCC25922為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基與主要試劑 腦心浸液液體培養(yǎng)基(brain heart infusion，BHI)、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(brain heart infusion agar，BHIA)(北京陸橋技術(shù)有限公司)；蛋白酶K(德國(guó)Calbiochem公司)；Tris-HCl(美國(guó)Biosharp公司)；EDTA(美國(guó)Amresco公司)；SeaKem Gold瓊脂糖(瑞士Lonza公司)；硫脲(美國(guó)Amresco公司)；XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(日本TaKaRa公司)；十二烷基硫酸鈉(美國(guó)Amresco公司)；十二烷基肌氨酸鈉(日本Sigma公司)；細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞裂解液、5×TBE(上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3主要儀器與設(shè)備 BD Phoenix Spec Nephelometer比濁儀(美國(guó)BD公司)；BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)；BD PhoenixTMNMIC/ID-4革蘭式陰性菌鑒定及藥敏板(美國(guó)BD公司)；恒溫水浴搖床(WS20，德國(guó)WIGGENS公司)；恒溫培養(yǎng)箱(Memmert，德國(guó)Binder公司)；恒溫水浴鍋(WNB400，德國(guó)Memmert公司)；CHEF MAPPER XA脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY，美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(VersaDoc，美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化 無菌操作將-80 ℃凍存的阪崎克羅諾桿菌接種于BHI中，36 ℃過夜培養(yǎng)，次日將培養(yǎng)液劃線接種至BHIA平板上，36 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2藥敏檢測(cè) 抗生素敏感性分析選用BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。無菌操作刮取BHIA平板上的新鮮菌落到比濁管，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至0.5 MCF，采用BD PhoenixTMNMIC/ID-4藥敏板進(jìn)行藥敏檢測(cè)，按照說明書進(jìn)行操作。BD PhoenixTMNMIC/ID-4藥敏板檢測(cè)項(xiàng)目19種，包括青霉素類(氨芐西林、哌拉西林)、頭孢類(頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶)、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類(氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦)、氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)、葉酸途徑抑制劑類(復(fù)方新諾明)、酰胺醇類(氯霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素)。

1.2.3PFGE分型 參照文獻(xiàn)[14]，優(yōu)化部分試驗(yàn)參數(shù)。將新鮮培養(yǎng)的阪崎克羅諾桿菌制備成菌懸液(4.0～4.5 MCF)，加入1%的SeaKem Gold瓊脂糖混合制成膠塊，將凝固的膠塊轉(zhuǎn)入0.1 mg·mL-1蛋白酶K和細(xì)胞裂解液的混合液54 ℃裂解3.5 h，用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切3.5 h，然后與1%的瓊脂糖制成電泳凝膠。電泳參數(shù)：電壓為6 V·cm-1，溫度為14 ℃，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間為2.16 s，最終轉(zhuǎn)換時(shí)間為54.17 s。電泳結(jié)束后，染色、脫色、成像，電泳圖譜用BioNumerics Version 6.6軟件進(jìn)行聚類分析。條帶位置差異容許度設(shè)置為0.5%，優(yōu)化值設(shè)為0.5%，PFGE帶型之間的相似度采用Dice系數(shù)來衡量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表1顯示，68株阪崎克羅諾桿菌分離株對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明16種抗生素均敏感。4株阪崎克羅諾桿菌具有耐藥性，耐藥率為5.88%。其中，對(duì)頭孢唑啉耐藥的菌株3株，對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株1株。18株菌表現(xiàn)為中介，其中，對(duì)頭孢唑啉中介的菌株16株，對(duì)氯霉素中介的菌株2株。所有菌株對(duì)其余16種抗生素均敏感。

表1 68株阪崎克羅諾桿菌的抗生素敏感性

2.2 PFGE分型結(jié)果

圖1顯示，68株阪崎克羅諾桿菌共形成58個(gè)PFGE帶型，相似度為20%～100%，分別命名為PT001～PT058型。帶型總體較分散，沒有明顯的優(yōu)勢(shì)帶型和聚集現(xiàn)象。相似度為100%的菌株被認(rèn)為屬于同一PFGE帶型[15]。其中，PT037帶型包含4株菌；PT050帶型、PT054帶型均包含3株菌；PT007帶型、PT043帶型、PT046帶型均包含2株菌；其余帶型各包含1株菌株。同一帶型的菌株樣品來源較集中，如PT037帶型的4個(gè)菌株均分離自黑龍江A乳品廠的配方粉，PT050帶型的3個(gè)菌株均分離自黑龍江B乳品廠的配方粉，PT054帶型的3個(gè)菌株均分離自黑龍江C乳品廠的配方粉，說明配方粉受同一來源克隆株污染的可能性較大。而分離自北京配方粉的菌株BQ02和分離自黑龍江配方粉的BQ26表現(xiàn)出相同的帶型PT043，提示乳粉生產(chǎn)過程中可能存在特定型別的菌株。

圖1 68株阪崎克羅諾桿菌的PFGE聚類分析

3 討論

克羅諾桿菌對(duì)嬰幼兒和免疫力低下的人群具有嚴(yán)重的危害性，因此，對(duì)克羅諾桿菌耐藥性進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。黃玉蘭等[16]對(duì)嬰幼兒食品和臨床病例中分離的109株克羅諾桿菌的耐藥性研究表明，嬰幼兒乳粉中克羅諾桿菌的菌株分離數(shù)低于其他食品，雖然食源性克羅諾桿菌對(duì)磺胺類藥物和氯霉素等的耐受性有逐年上升趨勢(shì)，但食品中克羅諾桿菌多重耐藥株檢出較少。王倩寧等[17]對(duì)羊奶粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離的克羅諾桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)29株克羅諾桿菌中的22株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲惡唑耐藥，2株對(duì)頭孢西丁耐藥，1株對(duì)阿莫西林耐藥，1株對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥，2株菌具有多重耐藥現(xiàn)象。本研究的藥敏結(jié)果顯示，68株分離株對(duì)所測(cè)試19種抗生素中的16種敏感，僅對(duì)頭孢唑啉和四環(huán)素耐藥，耐藥率分別為4.4%、1.5%，對(duì)頭孢唑啉和氯霉素的中介率分別為23.5%和2.9%，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株。相比于以上文獻(xiàn)報(bào)道，本研究中的阪崎克羅諾桿菌分離株耐藥性較低，可能與采樣地域、樣品種類有關(guān)。有研究認(rèn)為，耐藥基因在不同細(xì)菌間的傳遞，使原本對(duì)抗生素敏感的菌株產(chǎn)生“獲得性”耐藥[18]。因此，仍需加強(qiáng)克羅諾桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)。

PFGE分子分型方法辨識(shí)度高、穩(wěn)定性好，被廣泛運(yùn)用于克羅諾桿菌的分子分型及溯源研究[19]。柴云雷等[20]對(duì)嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌分離株進(jìn)行PFGE分子分型，將12株克羅諾桿菌分為11個(gè)帶型；甘辛等[21]研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)19個(gè)地區(qū)嬰兒配方粉來源的49株克羅諾桿菌圖譜共形成38個(gè)帶型；周蒂等[14]利用PFGE技術(shù)對(duì)配方奶粉加工過程分離的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)46株阪崎克羅諾桿菌共形成29種PFGE基因指紋圖譜，說明乳粉來源的菌株呈現(xiàn)出較高的基因多態(tài)性和離散性。本研究中，68株阪崎克羅諾桿菌共分為58個(gè)PFGE帶型，PFGE型別較分散，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

將PFGE分型結(jié)果與藥敏結(jié)果結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，同一PFGE帶型的菌株BQ55和BQ56均對(duì)頭孢唑啉中介，PT054帶型中的2個(gè)菌株BQ64和BQ65均對(duì)頭孢唑啉中介，但與它們同型別的菌株BQ63對(duì)所有測(cè)試的抗生素均敏感，菌株BQ35和BQ36同屬于PT007帶型，但它們的耐藥情況卻不同。說明本研究中克羅諾桿菌的耐藥性與其PFGE帶型的關(guān)聯(lián)性不大，此結(jié)果與許龍巖等[22]的研究一致。

本文研究了PFGE帶型與菌株耐藥性之間的相關(guān)性，但并未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)性。一方面是由于我國(guó)克羅諾桿菌食品分離株具有高度多態(tài)性[21]，另一方面與腸桿菌科其他屬病原菌相比，克羅諾桿菌屬菌株對(duì)常用抗生素較為敏感[16]。未來需分析更多的菌株，并結(jié)合耐藥基因檢測(cè)等其他手段來探究耐藥菌株間的聯(lián)系。