牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基單克隆抗體膠體金標(biāo)記試紙條制備

布日額，吳金花, 錫林高娃，陳金龍,王金良

奶牛隱性乳腺炎(sub-clinical mastitis of dairy cattle)是奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中的一種高發(fā)病，在內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率在50%以上，患牛臨床癥狀不易察覺，所產(chǎn)乳汁與健康奶牛所產(chǎn)奶沒有較大的區(qū)別，在飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境急劇變化等條件下極易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳腺炎[1-2]。無(wú)乳鏈球菌是引起奶牛隱型乳房炎的重要病原菌之一，屬B群鏈球菌(Group BStreptococcusagalactea，GBS)，患病奶牛生產(chǎn)的乳由于質(zhì)量差，營(yíng)養(yǎng)成分遭到破壞，混有人畜共患無(wú)乳鏈球菌，故極易對(duì)人類造成感染性危害，特別是對(duì)機(jī)體免疫力低下的老人及嬰幼兒其危害更為嚴(yán)重[3-4]。近年來(lái)，隨著我國(guó)人均牛奶消費(fèi)量的增加，奶牛養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和奶牛養(yǎng)殖密度的加大，再加上飼養(yǎng)福利條件相對(duì)較差,養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生與消毒工作難以規(guī)范化實(shí)施，奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，每年因奶牛隱性乳腺炎所帶來(lái)的直接或者間接經(jīng)濟(jì)損失巨大。

迄今為止，無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)常用方法側(cè)重于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離鑒定，如常規(guī)PCR鑒定等，這些方法均存在程度不等的缺陷和不足。傳統(tǒng)無(wú)乳鏈球菌的分離、培養(yǎng)、鑒定、檢測(cè)方法耗時(shí)，儀器依賴性強(qiáng)，無(wú)法滿足臨床對(duì)乳腺炎乳樣的快速檢測(cè)[5-7]。膠體金免疫層析技術(shù)實(shí)施方便、快速，便于基層使用和現(xiàn)場(chǎng)推廣使用，更加適合臨床無(wú)乳鏈球菌乳樣的快速檢測(cè)[8-10]。在該檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)品的制備過(guò)程中，單克隆抗體的高靈敏度，強(qiáng)特異性使得免疫膠體金層析技術(shù)在快速鑒定病原體，以及準(zhǔn)確的診斷方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，制備無(wú)乳鏈球菌相關(guān)診斷亞單位抗原的單克隆抗體，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基基因編碼類似大腸桿菌的菌毛樣結(jié)構(gòu)菌毛骨架蛋白部分，具有良好的抗原性，研究表明，該蛋白抗原可以作為無(wú)乳鏈球菌抗體的診斷抗原。本課題組在前期研究中，將BP抗原包被ELISA平板，用于臨床無(wú)乳鏈球菌隱性乳腺炎的篩查，國(guó)外也有類似研究報(bào)道[11-12]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，將奶牛無(wú)乳鏈球菌的BP基因進(jìn)行表達(dá)、純化，制備單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記后制備了快速檢測(cè)牛乳源性無(wú)乳鏈球菌的膠體金標(biāo)記檢測(cè)試紙條[13]。

1 材料與方法

1.1菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌BL21即用型感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、化膿性鏈球菌等菌種、pET30a(+)-BP重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；Babl/c小鼠購(gòu)自濟(jì)南市金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2主要試劑、器材 無(wú)乳鏈球菌山羊多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)制備并純化保存，硫酸卡那霉素、IPTG、HIS標(biāo)簽蛋白親和層析填料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；單抗亞類鑒定ELISA試劑盒購(gòu)自上海士峰生物科技有限公司。低分子量蛋白Marker、HAT、PEG1500、胎牛血清等為Thermo公司產(chǎn)品。

1.4重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化 將pET30a(+)-BP重組質(zhì)粒克隆轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化及蛋白含量測(cè)定。

1.5抗BP重組抗原單克隆抗體的制備

1.5.1小鼠免疫 選擇4只SPF級(jí)balb/c小鼠免疫，首免用純化的BP蛋白50 μg與等量的弗氏完全佐劑乳化后皮下注射，然后每間隔14 d進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共免疫3次，每次每只50 μg抗原與等量的弗氏不完全佐劑乳化混勻。3次加強(qiáng)免疫后，檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1∶10 000時(shí)，用100 μg抗原沖擊免疫，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合與篩選。

1.5.2細(xì)胞融合與篩選 無(wú)菌采集小鼠脾細(xì)胞，加入少量HAT備用。收集培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞洗滌3次，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按一定比例混合后，于37 ℃水浴1 min內(nèi)緩慢加入1 mL的PEG，靜置1 min。加入準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞于37℃，5% CO2的孵化箱中培養(yǎng)7 d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底時(shí)用間接ELISA 方法進(jìn)行篩選，檢測(cè)為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存?zhèn)溆?，將滅活的無(wú)乳鏈球菌(108CFU/孔)包被戊二醛預(yù)處理過(guò)的ELISA平板，對(duì)篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3單克隆抗體的制備與純化 首先向小鼠腹腔注入弗氏佐劑致敏，7 d后每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水。收集腹水并離心去除腹水中的細(xì)胞和油脂，用硫酸銨沉淀法及親和層析提取腹水中的IgG抗體，測(cè)得純化抗體的濃度。

1.6單克隆抗體的鑒定

1.6.1克隆抗體效價(jià)及雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性 將細(xì)胞株連續(xù)傳代15次，分別取細(xì)胞上清用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)并比較其穩(wěn)定性。

1.6.2抗體亞型鑒定 按照單抗亞類鑒定ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

納入和排除標(biāo)準(zhǔn)[2] ：①所有患者神經(jīng)功能損害體征持續(xù)時(shí)間超過(guò)1 h，NIHSS評(píng)分≥4分，顱腦CT檢查發(fā)現(xiàn)患者雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多發(fā)性腔隙性腦梗死；②排除3個(gè)月內(nèi)有卒中史和重大顱腦外傷史、可疑蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)出血既往史、顱內(nèi)腫瘤、及型出血傾向、活動(dòng)性內(nèi)出血、血壓異常升高（收縮壓超過(guò)180 mmHg或舒張壓超過(guò)100 mmHg）、不符合溶栓治療適應(yīng)征的患者。

1.7單克隆抗體的膠體金標(biāo)記 使用4H5抗體標(biāo)記金顆粒，抗體標(biāo)記量為6μg/mL，標(biāo)記pH值8.0，膠體金封閉液為10% BSA，無(wú)乳鏈球菌山羊多抗包被檢測(cè)線，檢測(cè)線噴涂抗體含量為1 mg/mL，質(zhì)控線噴涂含量為1.5 mg/mL的羊抗鼠二抗，具體標(biāo)記方法是利用杭州峰航科技有限公司的噴金標(biāo)機(jī)和連續(xù)劃膜機(jī)進(jìn)行。

1.8金標(biāo)試紙條靈敏度及特異性測(cè)試 將人工培養(yǎng)的乳腺炎無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并梯度稀釋至103～109CFU/mL，用制備的膠體金標(biāo)記檢測(cè)試紙條進(jìn)行靈敏度測(cè)試。利用制備的膠體金檢測(cè)試紙條分別對(duì)人工培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、化膿性鏈球菌含量均調(diào)整至108CFU/mL進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試其特異性。

2 結(jié) 果

2.1重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化 重組 pET30a(+)-BP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)終濃度為1 mmol 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，在約32 ku處出現(xiàn)清晰的目的條帶?？扇苄澡b定顯示，目的蛋白主要存在于沉淀中，沉淀經(jīng)變性、復(fù)性及His標(biāo)簽填料親和層析純化后，BCA法測(cè)定蛋白濃度為1.2 mg/mL(見圖1)。

M為蛋白Marker；1為pET30a(+)-BP誘導(dǎo)后；2為誘導(dǎo)后上清；3為破碎沉淀； 4為純化蛋白BP圖1 BP重組蛋白表達(dá)及純化SDS-PAGE鑒定Fig.1 Identification of recombinant protein expression and purification of BP by SDS-PAGE

2.2BP重組抗原單克隆抗體的制備 Balb/c小鼠經(jīng)4次免疫后，ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效達(dá)到1∶51 200(見圖2)，融合細(xì)胞經(jīng)多次亞克隆及篩選，再經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)對(duì)抗體進(jìn)行二次篩選，獲得1株穩(wěn)定的抗BP重組抗原的單克隆抗體，將其命名為4H5。純化后的單抗，經(jīng)Bradford法測(cè)定，結(jié)果顯示單抗含量為4.3 mg/mL(見圖3)。

圖2 4次免疫后小鼠血清效價(jià)Fig.2 Serum titers of mice serum after 4 times immunizations

M為蛋白Marker；1、2為純化后的單抗4H5圖3 單抗純化后SDS-PAGE鑒定Fig.3 Identification of purified McAb by SDS-PAGE

2.3單克隆抗體的鑒定

2.3.1單抗腹水效價(jià)及雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性 經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，4H5株單抗腹水的效價(jià)為1∶25 600。在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)連續(xù)傳至15代時(shí)，其培養(yǎng)上清效價(jià)仍然穩(wěn)定。

2.3.2單抗亞型鑒定 單抗亞型鑒定結(jié)果表明，該株單抗均屬于IgG1亞類。

2.4膠體金試紙條靈敏度 靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，制備的膠體金檢測(cè)卡最低可以檢測(cè)106CFU/mL的無(wú)乳鏈球菌(見圖4)。

2.5膠體金試紙?zhí)禺愋?特異性測(cè)試結(jié)果表明，制備的膠體金檢測(cè)卡與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、副結(jié)核桿菌、化膿性鏈球菌培養(yǎng)物人工污染牛乳均無(wú)反應(yīng)，與無(wú)乳鏈球菌培養(yǎng)物人工污染牛乳樣出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(見圖5)。

1為109 CFU/mL；2為108 CFU/mL；3為107 CFU/mL；4為106 CFU/mL；5為105 CFU/mL；6為104 CFU/mL；7為103 CFU/mL圖4 膠體金試紙條靈敏度測(cè)試Fig.4 Sensitivity test of colloidal gold labeled strip

1為無(wú)乳鏈球菌；2為金黃色葡萄球菌；3為大腸桿菌；4為沙門氏菌；5為化膿性鏈球菌；6為副結(jié)核桿菌圖5 膠體金標(biāo)記試紙條特異性測(cè)試Fig.5 Specificity test of colloidal gold labeled strip

3 討 論

無(wú)乳鏈球菌具有類似大腸桿菌的菌毛樣結(jié)構(gòu)，屬于菌體表面附屬物，能夠促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和定植，并介導(dǎo)無(wú)乳鏈球菌對(duì)抗菌肽AMPs的抗性。相關(guān)研究表明，BP基因編碼無(wú)乳鏈球菌菌毛結(jié)構(gòu)中的骨架亞基部分，具有良好的免疫保護(hù)性[14-15]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者曾嘗試針對(duì)無(wú)乳鏈球菌致病因子制備單克隆抗體或者多克隆抗體，并應(yīng)用于無(wú)乳鏈球菌的快速檢測(cè)。張新艷等[16]成功制備了針對(duì)羅非魚無(wú)乳鏈球菌的SIP蛋白的兩株單克隆抗體，成功建立了針對(duì)羅非魚無(wú)乳鏈球菌的雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果與PCR方法的符合率達(dá)到 98.33%。華亞南[17]于2016年制備了抗無(wú)乳鏈球菌多克隆抗體,建立了檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，并用此方法明確了羅非魚感染鏈球菌數(shù)量與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。但是尚未見到針對(duì)奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌菌毛亞單位BP制備單克隆抗體，并制備膠體金快速檢測(cè)試劑盒的研究報(bào)道。本課題組在前期研究中曾制備了針對(duì)牛乳腺炎Ia型菌株P(guān)I-2a菌毛島嶼3個(gè)亞基AP1-AP2-BP融合抗原的單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記制備檢測(cè)試紙條，對(duì)無(wú)乳鏈球菌加檢測(cè)后，結(jié)果顯示效果不佳。所以，經(jīng)進(jìn)一步篩選，顯示BP亞基抗原制備的單克隆抗體的檢測(cè)效果良好，特異性及靈敏度均達(dá)到檢測(cè)的要求。該研究屬于首次開展針對(duì)無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛亞單位BP制備單克隆抗體，并制備快速檢測(cè)牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌的膠體金標(biāo)記免疫層析試劑盒的研究。

本研究中共篩選出與無(wú)乳鏈球菌菌毛BP亞基蛋白有較好反應(yīng)的38株雜交瘤細(xì)胞株，將無(wú)乳鏈球菌(108CFU)滅活后，包被戊二醛預(yù)處理的ELISA板，對(duì)篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株培養(yǎng)上清進(jìn)行二次篩選，最終篩選出1株與無(wú)乳鏈球菌特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4H5。該株單抗細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)15代，其培養(yǎng)上清中單抗的效價(jià)依然穩(wěn)定，最終制備的腹水抗體效價(jià)達(dá)到1∶256 00。利用膠體金標(biāo)記該單抗，用無(wú)乳鏈球菌山羊多克隆抗體作為檢測(cè)線，最終制備的膠體金檢測(cè)卡最低可以檢測(cè)106CFU/mL的無(wú)乳鏈球菌，制備的膠體金檢測(cè)卡與人工培養(yǎng)的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、副結(jié)核桿菌等均沒有交叉反應(yīng)，這均表明制備的膠體金卡具有較好的特異性與敏感性。該研究成果為無(wú)乳鏈球菌性乳腺炎的快速檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查將提供有效的技術(shù)支持。

利益沖突：無(wú)。

引用本文格式：布日額，吳金花，錫林高娃,等. 牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼BP亞基單克隆抗體膠體金標(biāo)記試紙條制備[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):45-49. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.186