基孔肯雅病毒實(shí)驗(yàn)診斷進(jìn)展

徐佩佩，丁細(xì)霞

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)為單股正鏈RNA病毒，包含2個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1-4)和5種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E3、E2、6K、E1蛋白),根據(jù)E1氨基酸同源性被分為ECSA、亞洲、西非3種基因型[1]。CHIKV于1953年首次分離于坦桑尼亞，隨后在非洲、亞洲、歐洲散發(fā)，2005年留尼汪島的暴發(fā)波及138萬(wàn)人，出現(xiàn)嚴(yán)重腦炎、出血熱而導(dǎo)致死亡率急劇上升，截止2013年基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF)已播散至美洲?；颊咂鸩〕跗谥饕憩F(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、皮疹、乏力等非特異性臨床癥狀，與登革病毒(dengue virus, DENV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)、西尼羅病毒(west nile virus, WNV)感染早期癥狀相似，均以蚊子為傳播媒介，存在混合感染。且這幾種病毒感染的治療方法不同，尤其是對(duì)CHIKF有效的非甾體類(lèi)抗炎藥被嚴(yán)禁于DENV感染，而高水平的炎癥細(xì)胞因子使15%～30%的CHIKF患者最終發(fā)展成關(guān)節(jié)畸形甚至死亡[2]。2009年WHO公布的東南亞CHIKV防控指南提出：診斷CHIKF至少具備以下一項(xiàng)：病毒分離陽(yáng)性、CHIKV IgM抗體陽(yáng)性、間隔至少3周的CHIKV IgG抗體滴度4倍升高和RT-PCR陽(yáng)性，可通過(guò)噬斑減少中和試驗(yàn)或血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)排除阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong-nyong Virus，ONNV)或森林腦炎病毒等其他甲病毒或黃病毒感染[3]。2019年泛美抗風(fēng)濕聯(lián)盟聯(lián)合加勒比與安第斯風(fēng)濕病學(xué)會(huì)規(guī)定確診CHIKF的ELISA或RT-PCR試驗(yàn)敏感性需高于74.2%且特異性高于88.4%[2]。本文將從病毒分離、血清學(xué)抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)4個(gè)方面介紹CHIKF的實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展(表1)。

表1 基孔肯雅熱診斷方法及其特征
Tab.1 Characteristics of diagnosis method for CHIKF

檢測(cè)方法標(biāo)本類(lèi)型最佳檢測(cè)時(shí)限優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)參考文獻(xiàn)病毒分離血漿、血清,全血或組織發(fā)病3 d內(nèi)診斷金標(biāo)準(zhǔn);可對(duì)病毒株進(jìn)行溯源需在BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行;對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及設(shè)備要求高;無(wú)法早期診斷;敏感性低[4]抗體檢測(cè)血清或血漿IgM:發(fā)病第4 d到第2個(gè)月;IgG:發(fā)病第7 d到半年操作簡(jiǎn)單、快速;成本低;無(wú)需特殊設(shè)備,適合大規(guī)模篩查與其他甲病毒、黃病毒屬存在交叉;IgM檢測(cè)不能區(qū)分急性感染與近期感染;無(wú)法早期診斷[4][5]抗原檢測(cè)血清或血漿發(fā)病10 d內(nèi)早期診斷方法;操作簡(jiǎn)單、快速;成本低;適合大規(guī)模篩查僅適于早期檢測(cè)[6]分子生物學(xué)檢測(cè)血清、血漿或全血發(fā)病第1 d到第8 d早期診斷方法;可用于基因分型設(shè)備及價(jià)格昂貴;不適合大規(guī)模篩查;僅適于早期檢測(cè)[4]

1 病毒分離

病毒分離，是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，仍是目前診斷CHIKF的“金標(biāo)準(zhǔn)”。主要通過(guò)將病毒血癥患者的血液或感染組織接種于小鼠腦內(nèi)或接種于伊蚊細(xì)胞系(如C6/36、Aag-2)和其他病變效應(yīng)明顯的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如BHK-21，HeLa和Vero細(xì)胞)進(jìn)行分離[3]。不同基因型病毒對(duì)各種細(xì)胞敏感性存在差異，其中C6/36和BHK-21細(xì)胞較適合印度洋譜系CHIKV的分離；Aag-2、HeLa和Vero細(xì)胞較適合亞洲基因型CHIKV的分離[7]。盡管病毒分離的特異性高，同時(shí)可對(duì)所分離病毒株的來(lái)源及特征進(jìn)行鑒定，但其靈敏度低，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、條件要求高，需要在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且病毒分離時(shí)間長(zhǎng)，不適合于CHIKF的快速早期診斷及基層單位的推廣應(yīng)用。

2 血清學(xué)抗體檢測(cè)

目前用于檢測(cè)CHIKV的抗體方法, 主要包括免疫印跡、間接免疫熒光法、ELISA、血凝抑制試驗(yàn)(HI)、中和試驗(yàn)及膠體金免疫層析法。其中,包被抗原的間接ELISA法與檢測(cè)IgM 和(或)IgG 的ELISA 捕捉法是檢測(cè)CHIKV最常用的抗體檢測(cè)方法。

2.1免疫印跡法 2016年，Yang等[8]以重組E2為檢測(cè)抗原開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)CHIKV IgG的免疫印跡檢測(cè)試劑,其靈敏度為83.3%，特異性為96.7%。同年，Verma等[9]將重組E2應(yīng)用于免疫印跡以檢測(cè)10對(duì)血清樣本中的CHIKV IgM和IgG，準(zhǔn)確率達(dá)100%。但由于該方法的操作繁瑣，而很少應(yīng)用于臨床診斷。2019年泛美抗風(fēng)濕聯(lián)盟聯(lián)合加勒比與安第斯風(fēng)濕病學(xué)會(huì)發(fā)布的共識(shí)也未將免疫印跡法納入CHIKV的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

2.2間接免疫熒光法 間接免疫熒光法的應(yīng)用要求具備專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員及相關(guān)設(shè)備。目前，歐盟已開(kāi)發(fā)出診斷CHIKF的間接免疫熒光商品化試劑盒，該試劑盒在臨床應(yīng)用中也存在很多問(wèn)題，部分樣本結(jié)果判定困難，主觀意識(shí)較強(qiáng)，需要重復(fù)檢測(cè)樣品較多。但目前美國(guó)疾控中心和加勒比公共衛(wèi)生署對(duì)該試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性評(píng)估分別為96%和97%[10]。

2.3ELISA法 ELISA是目前最常用于傳染性病原的抗原、抗體檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)單，適合于大規(guī)模篩查。近年來(lái)針對(duì)CHIKV抗體檢測(cè)的間接ELISA法主要以E2蛋白為靶標(biāo)抗原，但因E2蛋白存在較多的半胱氨酸殘基導(dǎo)致蛋白可溶性差，一般以基因重組的E2蛋白[9,11-12]較常用于抗體檢測(cè)。其中，F(xiàn)umagalli等[12]以重組E2開(kāi)發(fā)的間接ELISA與Mayaro病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、Mucambo病毒和Aura病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，可用于Mayaro病毒與CHIKV共同流行區(qū)(如巴西等)作為鑒別診斷。美國(guó)疾控中心曾對(duì)2015年6月之前開(kāi)發(fā)的6種CHIKV IgM捕獲ELISA商品化試劑盒進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)歐盟和Inbios生產(chǎn)的試劑盒診斷準(zhǔn)確率分別為99%和100%，優(yōu)化后的Abcam試劑盒與疾控中心的診斷結(jié)果一致性高達(dá)99%，而另外3種試劑盒的敏感性均低于50%[13]。目前，也有報(bào)道應(yīng)用抗C蛋白單抗、E1單抗和E2單抗建立CHIKV IgM和(或)IgG捕獲ELISA法。其中，Damle等[14]首次應(yīng)用抗C蛋白IgG開(kāi)發(fā)捕獲ELISA以診斷CHIKF，與辛德畢斯病毒無(wú)交叉反應(yīng)；Galo等[15]開(kāi)發(fā)的IgM捕獲ELISA和競(jìng)爭(zhēng)法ELISA均與DENV無(wú)交叉反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低成本與加速檢測(cè)，Theillet等[16]把CHIKV IgM捕獲ELISA法的原理應(yīng)用于由自黏塑料與玻璃纖維紙組成的紙基分析裝置，上樣8～10 min后，檢測(cè)結(jié)果可由手機(jī)讀出，與ONNV無(wú)交叉反應(yīng)，但與DENV和ZIKV存在交叉反應(yīng)。為避免不同操作者采用手機(jī)讀取結(jié)果引起的偏差，Wang等[17]采用自制閱讀器開(kāi)發(fā)了可同時(shí)診斷CHIKV和DENV IgM及IgG的側(cè)向?qū)游鲈囼?yàn)，診斷性能較市售快速診斷試劑盒高。

3 抗原檢測(cè)方法

目前尚未有商品化的CHIKV抗原檢測(cè)試劑盒，但關(guān)于CHIKV的抗原診斷方法的研究報(bào)道不少。由于E1為CHIKV相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)蛋白，因此，檢測(cè)患者血清中E1抗原成為CHIKV抗原檢測(cè)試劑研究的靶標(biāo)。2015年，Okabayashi等[18]用E1單抗開(kāi)發(fā)了診斷CHIKF的膠體金免疫層析法，敏感性為89.4%，特異性為94.4%，但待檢樣本中亞洲基因型較少。2018年，Huits等[19]增加亞洲基因型樣本，并使用同對(duì)單抗進(jìn)行免疫層析試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這對(duì)單抗對(duì)亞洲基因型CHIKV的檢測(cè)敏感性只有33.3%。為進(jìn)一步了解該方法對(duì)不同基因型檢測(cè)的差異性，Tuekprakhon等[20]對(duì)3種基因型CHIKV的E1氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)配對(duì)單抗來(lái)源的ECSA型CHIKV在350位點(diǎn)處為谷氨酸，而亞洲型和西非型為天冬氨酸。并通過(guò)定點(diǎn)突變證實(shí)了該表位的突變是導(dǎo)致單抗結(jié)合能力下降的主要原因。為進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的敏感性及對(duì)不同基因型的檢測(cè)差異性，Tuekprakhon等[21]重新以ECSA型和亞洲型CHIKV免疫小鼠制備獲得一批能夠同時(shí)檢測(cè)到3個(gè)基因型的CHIKV特異性單抗，且其中兩株抗E1單抗與DENV、ZIKV、辛德畢斯病毒、ONNV、羅斯河病毒、Mayaro病毒、西部、東部及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，有望發(fā)展出一種特異性的CHIKV抗原檢測(cè)試劑盒。

4 分子生物學(xué)檢測(cè)

4.1RT-PCR 近年來(lái), 隨著分子生物學(xué)診斷方法的日益完善,各種RT-PCR方案已嘗試于病毒感染早期、抗體尚未出現(xiàn)時(shí)的檢測(cè)，其一般針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1基因[22-23]及包膜糖蛋白基因[24-25]。CHIKV的RT-PCR通常應(yīng)用于發(fā)病2～6 d的血漿或血清標(biāo)本。最近發(fā)現(xiàn)全血也可作為標(biāo)本檢測(cè)，且診斷性能與商品化檢測(cè)試劑盒基本一致[26]；對(duì)于發(fā)病1周內(nèi)難以采集血液標(biāo)本的患者，可以唾液標(biāo)本代替檢測(cè)[27]；對(duì)于哺乳期患者，母乳標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)限可延長(zhǎng)至發(fā)病第23 d[28]；精液和尿液檢測(cè)時(shí)限還可延長(zhǎng)至發(fā)病第30 d[29]。針對(duì)CHIKF與其他蟲(chóng)媒病毒病共同流行的特點(diǎn)，Cecilia等[30]開(kāi)發(fā)了可用于同時(shí)診斷CHIKV和DENV的多重實(shí)時(shí)RT-PCR，Liu等[22]和Calvo等[24]分別開(kāi)發(fā)了可用于同時(shí)診斷CHIKV和ZIKV感染的一步法多重實(shí)時(shí)定量RT-PCR及同時(shí)診斷CHIKV、ZIKV與DENV的一步法多重RT-PCR。Giry等[25]針對(duì)DENV、鉤體病等在留尼汪島的交叉流行特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了能同時(shí)區(qū)分CHIKV、DENV和鉤端螺旋體感染的一步法多重實(shí)時(shí)RT-PCR。最近，Wu等[31]開(kāi)發(fā)了可用于同時(shí)診斷CHIKV、DENV、ZIKV和YFV的單管四重實(shí)時(shí)RT-PCR，該方法對(duì)CHIKV的檢測(cè)下限為11拷貝/反應(yīng)，與乙腦、乙肝、丙肝、腸道病毒71型、巨細(xì)胞病毒均無(wú)交叉，且與商品化試劑檢測(cè)結(jié)果相一致。Boga等[32]還開(kāi)發(fā)了可用于同時(shí)診斷CHIKV、DENV、ZIKV、YFV和WNV的多重實(shí)時(shí)RT-PCR，該檢測(cè)體系的準(zhǔn)確率為94.4%，與蜱傳腦炎病毒和日本腦炎病毒均無(wú)交叉，這些多重RT-PCR試劑可用于疫區(qū)旅行者的感染篩查及常見(jiàn)蟲(chóng)媒病毒的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

4.2RT-LAMP 這是一種逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，只需水浴鍋或金屬浴，適合于基層醫(yī)療單位及出入境口岸等機(jī)構(gòu)使用。然而，早期的RT-LAMP試劑是2007年到2012年開(kāi)發(fā)的，引物設(shè)計(jì)所能利用的信息有限。2018年，Lopez-Jimena等[33]利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的110條CHIKV序列，通過(guò)LAVA軟件重新設(shè)計(jì)了靶向保守區(qū)域6K-E1的引物，開(kāi)發(fā)了單管一步法實(shí)時(shí)RT-LAMP，力求涵蓋所有可能流行的CHIKV毒株，該法陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97%，陰性預(yù)測(cè)值為100%，在標(biāo)本儲(chǔ)存條件不佳的情況下仍表現(xiàn)出較好的診斷性能。

4.3宏基因組測(cè)序 宏基因組測(cè)序是目前唯一能識(shí)別臨床樣品中所有潛在病原體的序列信息的診斷方法。2015年，Greninger等[34]首次將宏基因組納米孔測(cè)序與實(shí)時(shí)生物信息學(xué)分析應(yīng)用于CHIKF診斷，6 h內(nèi)即可完成檢測(cè)，但平均納米孔讀取錯(cuò)誤率高達(dá)20.6%，與樣本間交叉污染有關(guān)。2016年，Sardi等[35]將宏基因組測(cè)序應(yīng)用于診斷CHIKV與ZIKV的共同感染。2018年，Kafetzopoulou等[36]成功將宏基因組測(cè)序應(yīng)用于CHIKV與DENV共同感染的鑒定。進(jìn)一步縮短文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間、降低檢測(cè)閾值、優(yōu)化生物信息學(xué)工具、控制交叉污染與降低成本之后，有望將宏基因組測(cè)序應(yīng)用于基層醫(yī)療點(diǎn)的急性發(fā)熱性疾病的鑒別診斷與共同感染的鑒定。

綜上所述，鑒于CHIKV與其他蟲(chóng)媒病毒感染存在相似的臨床癥狀，不同病毒感染的臨床治療方式存在差異。因此，方便、快捷的CHIKV實(shí)驗(yàn)室診斷方法將有利于CHIKF的臨床診治。由于流行疫區(qū)往往存在幾種蟲(chóng)媒病毒交替流行的特點(diǎn)，患者也可出現(xiàn)幾種病毒同時(shí)感染的可能。因此，近3年CHIKV在實(shí)驗(yàn)室診斷方面主要致力于：制備特異性單克隆抗體建立ELISA法檢測(cè)IgM 和(或)IgG、針對(duì)保守區(qū)域開(kāi)發(fā)敏感性高且涵蓋3種基因型CHIKV的抗原檢測(cè)試劑、開(kāi)發(fā)可用于同時(shí)診斷CHIKV與其他蟲(chóng)媒病毒感染的多重RT-PCR方法，以及簡(jiǎn)化診斷方法與降低成本以促進(jìn)CHIKV診斷試劑在基層的推廣。盡管目前針對(duì)CHIKV開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法已經(jīng)不少，但真正獲得生產(chǎn)許可的商品化診斷試劑為數(shù)不多，相對(duì)于昂貴的核酸檢測(cè)試劑，基于ELISA和膠體金免疫層析的IgM/IgG抗體和抗原檢測(cè)方法將是更好的選擇。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：徐佩佩，丁細(xì)霞.基孔肯雅病毒實(shí)驗(yàn)診斷進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):60-64. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.188