miR-71通過IL-23/Th17信號通路對人胃早癌腫瘤浸潤免疫細胞的影響

易靜 龔錦文 趙靜 詹云凱 段志剛 呂婧

江西省九江市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科（江西九江332000）

胃癌作為我國發(fā)病率第一位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，胃早癌以其除消化不良外無癥狀和特異性表現(xiàn)、服用抑酸藥可以緩解癥狀和病灶小不易發(fā)現(xiàn)為特點，臨床上早期不易被發(fā)現(xiàn)而延誤治療[1-3]。目前的診斷方法以內(nèi)鏡為主，腫瘤標志物為輔[4]。腫瘤中浸潤的免疫細胞水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后積極相關(guān)[5]。IL-23是具有促炎作用的細胞因子，在分子空間構(gòu)型上IL-23 與JAK-2激酶比鄰，可與Th17 相互作用促進效應(yīng)細胞分化成熟并使其增生活化，導(dǎo)致器官特異性炎癥反應(yīng)[6-7]。miR-71 以其廣泛參與生物學調(diào)控、在各種腫瘤中表達均異常等特點已然成為腫瘤分子靶向治療的研究熱點，目前關(guān)于胃早癌的報道主要集中在內(nèi)鏡和藍激光成像等治療手段方面[8-9]，對于miR-71表達對胃早癌患者的影響研究缺乏系統(tǒng)報道。本研究分析血清miR-71表達表達通過IL-23/Th17信號通路對人胃早癌腫瘤浸潤免疫細胞的影響，以期為胃癌臨床治療和提前預(yù)防提供新的研究靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象抽取2017年3月至2019年3月于我院就診的60例胃早癌為胃癌組，另于我院隨機抽取同期健康體檢者60例為對照組。胃癌組和對照組組基本概況見表1。納入標準：（1）經(jīng)病理學活檢確診為淺表性胃癌；（2）腫瘤侵及胃壁肌層，但大小不超過1/2者；（3）未進行放療和化療；排除標準：（1）心、肝、腎等器官功能嚴重障礙；（2）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移[10]。本研究符合倫理學證明，所有參與研究的受試對象均同意并簽署知情同意書。

表1 胃癌組和對照組基本概況Tab.1 Basic overview of the gastric cancer group and the control group例

1.2 主要儀器和試劑快速總RNA 提取試劑盒（Sigma，RNB100-50RXN）、NanoDrop 2000儀器（Thermo Scientific）、PrimeScript RT 試劑盒（Takara Bio，RR047A）、SYBR-Green Premix Ex Taq（Takara Bio，DRR081A）、Anti-JAK2 antibody（abcam，ab-108596）、Anti-IL-23R antibody（abcam，ab45420）、Anti-CD8 antibody（abcam，ab4055）、Anti-CD68 antibody（abcam，ab125212）、Image-iTTMFixative Solution（Thermo Fisher，F(xiàn)B002）、PRISM 7900 序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems）、高通量測序儀（Life Technologies）

1.3 研究方法采用熒光定量PCR實驗測定血清中miR-71的mRNA表達，以U6 作為內(nèi)參，miR-71的引物設(shè)計見表2。采用HE 染色法檢測人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤情況及并依據(jù)浸潤情況分級。采用免疫組化法檢測人胃早癌巨噬細胞和CD8+T細胞的浸潤情況。采用Western Blot和蛋白免疫組化染色法檢測miR-71表達對IL-23/Th17信號通路的影響。

免疫組化：將手術(shù)石蠟切片中仍能見到癌組織患者的標本進行免疫組化檢測，防脫片處理后行4 μm 厚度切片，65℃烤片過夜，然后將切片組織置于二甲苯及酒精中，常規(guī)脫蠟至水，采用梓檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法進行組織抗原修復(fù)，H2O2孵育后每張切片滴加60 μL 一抗，PBS 清洗后每張切片滴加60 μL 二抗，PBS 漂洗后滴加60 μL DBS，復(fù)染后封固。

Western Blot：收集組織蛋白提取后進行蛋白濃度的測定，灌膠跑電泳后切膠轉(zhuǎn)模，封閉1～2 h，加入抗體孵育過夜，棄一抗后孵育二抗，最后顯影選擇蛋白條帶。

熒光定量PCR：釆用SYBR-Green Premix Ex Taq 試劑盒檢測組織中miR-71的mRNA表達，在Bio-Rad 上實時定量PCR 儀上完成擴增，釆用溶解曲線和瓊脂糖電泳分析擴增產(chǎn)物特異性，每份樣本重復(fù)檢測3次。

表2 miR-71 引物設(shè)計Tab.2 miR-71 primer design

1.4 統(tǒng)計學方法采用t檢驗和χ2檢驗實現(xiàn)兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-71 mRNA表達水平由圖1可知，胃癌早期患者（胃癌組）的miR-71 mRNA表達水平為（1.82 ± 0.17），對照組的miR-71 mRNA表達水平為（5.35 ± 0.41）故相較對照組，胃癌組miR-71 mRNA表達水平極顯著下調(diào)（P＜0.01）。將胃癌組按照TEM 分期分為Ⅰ期和Ⅱ期，TEMⅠ期的miR-71 mRNA表達水平為（2.52 ± 0.33），TEMⅡ期的miR-71 mRNA表達水平為（1.63±0.21），TEMⅠ期和TEMⅡ期的miR-71 mRNA表達水平較對照組均下調(diào)（P＜0.01）。

2.2 人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤情況及分級由圖2可知，通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，癌巢周邊的免疫細胞的數(shù)目最多，遠超癌巢內(nèi)部的免疫細胞和遠處免疫細胞的數(shù)目；形態(tài)呈篩狀退化的癌巢以及散在凋亡腫瘤細胞附近的浸潤免疫細胞數(shù)目遠超形態(tài)上充滿腫瘤細胞退化嚴重的癌巢。由圖3可知，以無免疫細胞浸潤、少量免疫細胞浸潤、較多免疫細胞浸潤和大量免疫細胞浸潤為依據(jù)，將免疫細胞的浸潤深度分為T1～T4 級，發(fā)現(xiàn)不同浸潤深度患者T1為5例，T2為26例，T3為23例，T4為6例。

圖1 miR-71的mRNA表達水平Fig.1 mRNA expression level of miR-71

圖2 人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤情況Fig.2 Infiltration of immune cells in human gastric early cancer

圖3 人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤深度分級Fig.3 Invasion depth grading of human gastric early cancer tumors

2.3 免疫細胞不同浸潤深度患者血清miR-71的相對含量由圖4可知，胃早癌患者免疫細胞浸潤深度T1 級的miR-71 mRNA表達水平為（2.52 ±0.23），胃早癌患者免疫細胞浸潤深度T2 級的miR-71 mRNA表達水平為（2.01±0.35），胃早癌患者免疫細胞浸潤深度T3 級的miR-71 mRNA表達水平為（1.81±0.29），胃早癌患者免疫細胞浸潤深度T4級的miR-71 mRNA表達水平為（1.56 ± 0.26），相較于T4 級的miR-71 mRNA表達量，T1 級的miR-71 mRNA表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），T2 級的miR-71 mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。

2.4 胃早癌巨噬細胞和CD8+ T細胞浸潤情況由圖5可知，癌巢內(nèi)部的CD8+T細胞數(shù)目最少，其次為遠離癌巢的CD8+T細胞，而CD8+T細胞最富集的部位仍是癌巢周邊。癌巢內(nèi)部的巨噬細胞數(shù)目最少，其次為遠離癌巢的巨噬細胞，而巨噬細胞最富集的部位仍是癌巢周邊。

圖4 不同浸潤深度患者血清miR-71的相對含量Fig.4 Relative levels of serum miR-71 in patients with different infiltration depth

圖5 胃癌患者巨噬細胞和CD8+ T細胞浸潤情況Fig.5 Infiltration of macrophages and CD8+ T cells in gastric cancer patients

2.5 miR-71表達對IL-23/Th17信號通路的影響由圖6可知，采用免疫組織化學染色法檢測胃癌患者的JAK-2和IL-23R表達，TEMⅠ期組和TEMⅡ期組JAK-2蛋白表達水平相較對照組上調(diào)；TEMⅠ期組和TEMⅡ期組IL-23R蛋白表達水平相較對照組上調(diào)。由圖7和圖8可知，TEMⅠ期組和TEMⅡ期組JAK-2蛋白表達水平相較對照組明顯上調(diào)（P＜0.01），TEMⅠ期組和TEMⅡ期組JAK-2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TEMⅠ期組和TEMⅡ期組IL-23R蛋白表達水平相較對照組上調(diào)（P＜0.01），TEMⅠ期組和TEMⅡ期組IL-23R蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

注：A、D，對照組組；B、E，TEMⅠ期；C、F，TEMⅡ期

圖7 miR-71表達對IL-23/Th17信號通路的影響Fig.7 Effect of miR-71 expression on IL-23/Th17 signaling pathway

圖8 miR-71表達對IL-23/Th17信號通路的影響Fig.8 Effect of miR-71 expression on IL-23/Th17 signaling pathway

3 討論

本研究以胃早癌患者作為研究對象，研究了患者血清miR-71表達通過IL-23/Th17信號通路對人胃早癌腫瘤浸潤免疫細胞的影響。采用熒光定量PCR實驗測定血清中miR-71的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)miR-71的mRNA表達相較對照組組極顯著下調(diào)（P＜0.01），且TEMⅠ期和TEMⅡ期的miR-71 mRNA表達水平較對照組組均極顯著下調(diào)（P＜0.01）。采用HE 染色法檢測人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤情況及并依據(jù)浸潤情況分級，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在癌巢中央、癌巢周邊和遠離癌巢處均可見腫瘤免疫細胞分布，且癌巢周邊的免疫細胞的數(shù)目最多，遠超癌巢內(nèi)部的免疫細胞和遠處免疫細胞的數(shù)目，形態(tài)呈篩狀退化的癌巢以及散在凋亡腫瘤細胞附近的浸潤免疫細胞數(shù)目遠超形態(tài)上充滿腫瘤細胞退化嚴重的癌巢。跟據(jù)免疫細胞不同浸潤深度（無免疫細胞浸潤、少量免疫細胞浸潤、較多免疫細胞浸潤和大量免疫細胞浸潤）分為T1～T4 級，發(fā)現(xiàn)胃癌患者的miR-71 血清表達水平與免疫細胞浸潤分級呈負相關(guān)趨勢。采用免疫組化法檢測人胃早癌巨噬細胞和CD8+T細胞的浸潤情況，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞和巨噬細胞的分布也為為癌內(nèi)，癌周、和遠處；癌巢內(nèi)部的巨噬細胞和CD8+T細胞數(shù)目最少，其次為遠離癌巢的巨噬細胞和CD8+T細胞，而巨噬細胞和CD8+T細胞最富集的部位仍是癌巢周邊。最后采用Western Blot和蛋白免疫組化染色法檢測miR-71表達對IL-23/Th17信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Western Blot的結(jié)果和蛋白免疫組化染色法的結(jié)果一致，均顯示TEMⅠ期組和TEMⅡ期組JAK-2和IL-23R蛋白表達水平相較對照組組極顯著上調(diào)（P＜0.01），TEMⅠ期組和TEMⅡ期組JAK-2和IL-23R蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05），說明miR-71表達對人胃早癌腫瘤浸潤免疫細胞的影響與激活I(lǐng)L-23/Th17信號通路有關(guān)。

胃早癌的臨床上特異性表現(xiàn)為粘膜上皮可見白色不透光物質(zhì)、微血管擴張，早癌的在臨床在采取內(nèi)鏡分型可以分為為隆起型Ⅰ型、淺表型Ⅱ型（a、b、c）和凹陷型Ⅲ型[11-12]。BRASACCHIO 等[13]研究發(fā)現(xiàn)胃癌的臨床不良表現(xiàn)與p300/CBP 相關(guān)蛋白（PCAF）表達下調(diào)有相關(guān)，并且是侵襲性和侵襲性腫瘤的潛在生物標志物。PCAF 主要以PCF/ADA3 調(diào)節(jié)的內(nèi)源途徑為中心的促凋亡機制可以影響從惡變前到惡變的進展，從而實現(xiàn)對胃癌的抑瘤機制作用。LIN 等[14]研究發(fā)現(xiàn)了適合早期胃癌的N 分類系統(tǒng)，這種新型的TNM 分期系統(tǒng)由T1N0、T1N1′[1-6 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（LN）]和T1N2′（≥7個轉(zhuǎn)移性LN）組成，具有更好的預(yù)測能力，可用于準確預(yù)測早期胃癌患者的5年總生存期。ESAKI等[15]研究用于早期胃癌的術(shù)后胃（ESD-P）的內(nèi)窺鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）發(fā)現(xiàn)，對于ESD-P 比ESD-N更耗時，較長的手術(shù)時間與縫合線或吻合部位的病變呈顯著正相關(guān)趨勢；然而ESD-P和ESD-N 均可實現(xiàn)高治愈率切除率的治療，并且早期胃癌治療的預(yù)后不良事件發(fā)生率低。即使在術(shù)后胃中也可以選擇ESD 作為早期胃癌的治療，只要注意縫合線或吻合部位的病變即可。LUO 等[16]研究微探頭內(nèi)鏡超聲檢查預(yù)測早期胃癌侵襲深度的臨床效用，經(jīng)雙變量混合效應(yīng)模型來計算靈敏度與特異性考察發(fā)現(xiàn)，微探頭內(nèi)鏡超聲檢查對早期胃癌的浸潤深度具有中等診斷能力，亞組分許表明診斷實用程序受到種族的影響。TAKEUCHI 等[17]研究前哨淋巴結(jié)（SN）與胃癌的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，SN 盆中的巨噬細胞轉(zhuǎn)移，淋巴侵襲和鑒定的淋巴結(jié)數(shù)量≥5是胃癌患者中非SN 盆地LN 轉(zhuǎn)移的危險因素。通過CART 分析確定了預(yù)測模型發(fā)現(xiàn)SN 盆中的巨噬細胞轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯的患者被認為是LN 轉(zhuǎn)移的最高風險。GUO 等[18]研究發(fā)現(xiàn)emu-miR-71可能參與原噬菌體的發(fā)育，其能夠在體外實現(xiàn)與emu-nlk的3′-UTR 結(jié)合，編碼細胞分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致熒光素酶活性的顯著下調(diào)。將emu-miR-71 模擬物轉(zhuǎn)染到原始細胞中可以實現(xiàn)對emu-NLK的抑制表達。YANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶（CHS）和幾丁質(zhì)酶（CHT）受miR-71和miR-263的調(diào)控，在幾丁質(zhì)生物合成和降解中能發(fā)揮新功能和平衡調(diào)節(jié)模式。ZHENG 等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-71可以影響巨噬細胞的功能，主要通過影響編碼小RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的關(guān)鍵組分的Ago1和Ago4 上調(diào)表達實現(xiàn)。

綜上所述，miR-71 血清表達水平與人胃早癌腫瘤免疫細胞浸潤深度呈負相關(guān)趨勢，而其機制與激活I(lǐng)L-23/Th17信號通路有關(guān)，而miR-71對腫瘤浸潤免疫細胞中的樹突狀細胞和淋巴細胞的影響還需要進一步研究和大量的實驗樣本進行驗證。