宏基因組測序在感染性疾病診治中的應(yīng)用進展

朱美利 張劍青 趙芝煥

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科（昆明650032）

感染性疾病是由細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體及其產(chǎn)物導(dǎo)致人體局部或全身性炎癥，臨床表現(xiàn)多樣，病情復(fù)雜，病死率較高，及時明確病因，采取針對性治療措施，能較好控制疾病的進展。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法，由于操作復(fù)雜，耗時長，檢測效率低等特點，不能滿足感染性疾病及時診治的需要。臨床上急需一種高效、準確、全面的病原體檢測方法，指導(dǎo)感染性疾病及時診斷及治療。

高通量測序技術(shù)，又稱下一代測序技術(shù)，是相對于Sanger測序法為代表的傳統(tǒng)測序技術(shù)而言的新型測序手段[1]。高通量測序采用的是并行測序技術(shù)，單次運行可以完成上百萬甚至千萬次測序?qū)嶒?，產(chǎn)出的序列數(shù)據(jù)量大，運用該技術(shù)能夠一次性檢測獲得樣品中可能感染的多種病原體基因組序列，對混合侵入性感染樣品中多種病原菌檢測鑒定具有很好的應(yīng)用[2]。

宏基因組測序是高通量測序在微生物研究中的一個重要應(yīng)用，是對環(huán)境樣品中的微生物遺傳物質(zhì)進行高通量測序，該方法能夠快速、準確、高效獲得整個微生物群的基因組信息，不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，直接從環(huán)境中提取微生物的遺傳物質(zhì)，通過基因分析鑒定微生物類型。本文主要介紹宏基因組測序在感染性疾病病原菌鑒定中的應(yīng)用，旨在為臨床醫(yī)生在感染性疾病的診治中提供一個更實用、可靠的檢測手段。

1 感染性疾病的診治現(xiàn)狀

感染性疾病是造成全球患者發(fā)病及死亡的主要原因，造成較重的疾病負擔[3]。病原體的早期識別和準確診斷對及時、特異、有效的治療感染性疾病至關(guān)重要[4]。由于抗生素、激素、免疫抑制劑的大量使用，惡性腫瘤、免疫缺陷患者增多，臨床病原體呈現(xiàn)復(fù)雜化、多樣化的趨勢，致病菌難以準確鑒定，感染性疾病診治困難。傳統(tǒng)微生物檢測方法很多，其中標本培養(yǎng)是病原體診斷的金標準，需預(yù)估病原體類型，提供適宜的培養(yǎng)條件，耗時長、操作復(fù)雜，易受臨床抗生素的使用、機體免疫狀態(tài)的影響，檢出率低[5]；血清學(xué)法目前研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量有限，難以滿足多樣化病原體檢測需求；PCR 法需預(yù)估可能的病原體，無法完成高通量檢測，檢測效率低；基因芯片只能對已知病原體進行篩查，無法檢測新的病原體。傳統(tǒng)病原體檢測法的局限性阻礙了感染性疾病病原體的快速檢測和鑒定，延誤理想的治療時間。各種新發(fā)和再發(fā)的感染性疾病、不易發(fā)現(xiàn)的多重感染以及不明病因的發(fā)熱等，都給人類健康帶來了巨大的威脅，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。宏基因組測序以其快速、高效、準確的微生物檢測優(yōu)點運用于感染性疾病的診治[6]。

2 宏基因組測序在感染性疾病診治中的應(yīng)用

隨著環(huán)境的變化，全球人口老齡化加劇，感染性疾病患病率及病死率增加。傳統(tǒng)病原體檢測方法難以滿足臨床感染性疾病高效診治的需求。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序成本的大幅降低，宏基因組測序已成為一種有希望用于感染性疾病準確診斷的通用病原體檢測方法[7]。宏基因組測序可以對任何類型的病原體進行鑒定，甚至可以用于識別新的病原體，這可能會替代許多目標病原體檢測[8]，現(xiàn)從以下四個方面介紹宏基因組測序指導(dǎo)臨床感染性疾病的診治。

2.1 宏基因組測序在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用呼吸系統(tǒng)感染是臨床常見病、多發(fā)病，是造成嬰幼兒、兒童、老人及免疫低下患者發(fā)病及致死的重要因素。有研究[9-10]顯示，在成人社區(qū)獲得性肺炎中，由于病原菌培養(yǎng)的靈敏度低、時間要求長，血清學(xué)和PCR 試驗檢測的微生物數(shù)量有限等原因，僅有38%的病原菌能夠被檢測出來。已有報道宏基因組測序運用于呼吸系統(tǒng)感染診治中，ZOU 等[11]利用宏基因組測序在不明原因肺炎患者中檢測出麻疹病毒，表明宏基因組測序在挑剔病原菌鑒定中具有一定優(yōu)勢。LI 等[12]對20例可疑肺部感染患者的肺組織標本進行檢測，結(jié)果顯示，宏基因組測序與培養(yǎng)法相比，細菌鑒定的敏感性和特異性分別為100%、76.5%，陰性預(yù)測值為100%，該研究中宏基因組測序比其他檢測法能鑒定出更多的病原菌，涵蓋難以檢測的厭氧菌和挑剔菌，具有潛在的速度及敏感性優(yōu)勢。XIE 等[13]對ICU 病房重癥肺炎患者進行研究，130例行常規(guī)臨床檢測為對照組，48例行宏基因組測序為觀察組，兩組根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整抗生素方案，結(jié)果顯示，觀察組28 d 病死率明顯低于對照組（16.7%vs.37.7%），90 d 病死率也明顯低于對照組（16.7%vs.42.3%），宏基因組測序檢出致病菌陽性率明顯高于對照組（68.7%vs.45.4%），表明宏基因組測序比常規(guī)檢測能夠更快速、準確地檢測病原體，及時調(diào)整抗生素，顯著降低重癥肺炎的病死率。宏基因組測序在呼吸道感染性疾病病原體檢測中具有較高的檢測效率，能快速、準確檢測病原菌，提高呼吸系統(tǒng)感染性疾病的精準診治能力。

2.2 宏基因組測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用全球中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染具有較高的發(fā)病率及病死率，造成嚴重的國際負擔，全球?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染的高質(zhì)量診治能力具有較大的需求[14]。由于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法的局限性，半數(shù)以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例不能明確診斷[15-17]。宏基因組測序法克服傳統(tǒng)檢測法的局限性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中地位越來越高。BROWN等[18]對44例運用宏基因組測序確診腦炎的患者病例進行回顧性分析后，認為宏基因組測序應(yīng)被視為慢性和復(fù)發(fā)性腦炎的一線診斷實驗。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染由多種微生物引起，已確定有100多種不同的病原體可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染[19]。病毒是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要原因[20]，延誤及時有效的治療將導(dǎo)致病毒性腦炎更高的病死率和嚴重的神經(jīng)后遺癥[21-22]。已有較多研究報道宏基因組測序成功鑒定出導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒類型[23-24]。MAI 等[25]利用宏基因組測序在1例可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者尿液中檢測出日本腦炎病毒，經(jīng)PCR和血清學(xué)證實該結(jié)果，這是第一次在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病毒的存在。中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌感染也較常見，GUO 等[26]研究中腦脊液宏基因組測序與臨床檢測法相比，細菌檢測敏感性從55.6%提高到68.7%，表明宏基因組測序能提高細菌性腦膜炎患者病原菌檢測的總體陽性率。FAN等[27]對4例可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液進行宏基因組測序，48 h內(nèi)均檢出布魯氏菌，利用PCR和Sanger測序?qū)ι鲜鼋Y(jié)果進行驗證，而培養(yǎng)法僅有其中1例患者腦脊液培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)布魯氏菌為陽性，表明宏基因組測序檢測病原菌比培養(yǎng)法更迅速、高效、準確。YAO 等[28]報道了3例腦脊液培養(yǎng)陰性，經(jīng)腦脊液宏基因組測序確診單核細胞增多性李斯特菌感染病例，第一次成功將宏基因組測序技術(shù)運用于單核細胞增多性李斯特菌感染的確診。真菌導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染并不少見，尤其在免疫缺陷患者中，真菌感染是毀滅性的，病死率高，存活個體遺留持久的神經(jīng)后遺癥[29-32]。WILSON 等[33]對7例腦膜炎患者的腦脊液行宏基因組測序，4例患者中檢測出真菌感染，病例1為免疫缺陷患者，檢出新型隱球菌，血清學(xué)檢測驗證該結(jié)果；病例2為可疑神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，覆蓋細菌、真菌、皰疹病毒、結(jié)核的治療，效果不佳，宏基因組測序腦脊液發(fā)現(xiàn)組織胞漿菌莢膜，與真菌培養(yǎng)及PCR 結(jié)果一致；病例3是診斷困難患者，常規(guī)臨床檢測陰性，腦脊液宏基因組測序發(fā)現(xiàn)米曲霉菌，腦脊液PCR檢測驗證該結(jié)果；病例4 臨床常規(guī)微生物檢測陰性，甚至腦組織活檢未能明確診斷，腦脊液宏基因組測序發(fā)現(xiàn)杜氏假絲酵母菌。該研究表明宏基因組測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染診斷方面比傳統(tǒng)檢測法更敏感、準確，在真菌感染診治中具有較高的運用價值。已有文獻報道宏基因組測序運用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲感染鑒定[34-36]。LIU 等[37]報道1例診斷困難的可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例，腦脊液宏基因組測序發(fā)現(xiàn)豬帶絳蟲DNA，確診腦囊蟲病，抗寄生蟲治療后，病情緩解，復(fù)查腦脊液豬帶絳蟲DNA 量大幅下降，該研究第一次將宏基因組測序技術(shù)運用于腦囊蟲病的診斷，結(jié)合病情轉(zhuǎn)歸進一步驗證檢測結(jié)果。

宏基因組測序作為一種快速、低成本和高通量的病原體DNA測序技術(shù)，已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各類病原體感染檢測，對比傳統(tǒng)病原體檢測法，具有較高檢測效率及準確性，指導(dǎo)臨床治療，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的快速診治水平。

2.3 宏基因組測序在血液系統(tǒng)感染中應(yīng)用血液感染是臨床上重癥感染性疾病之一，易誘發(fā)膿毒血癥，導(dǎo)致較高的發(fā)病率及病死率[38-39]，早期快速識別致病微生物、及時抗生素治療，能降低病死率，減少住院時間、相關(guān)費用和抗生素使用[4，40-42]。由于培養(yǎng)法及分子檢測技術(shù)的局限性，血流感染病原體診斷困難。宏基因組測序運用于血液感染病原體識別已有報道[43-44]。GRUMAZ 等[45]對48例膿毒血癥的研究顯示，膿毒血癥發(fā)病時：血培養(yǎng)、宏基因組測序病原菌檢測陽性率分別為33%、72%，從整個研究期間來看，病原菌陽性率分別為11%、71%，該研究表明宏基因組測序在血液感染病原體檢測中具有更高檢測效率。同樣的LONG 等[46]對78例可疑膿毒血癥患者的血漿行宏基因組測序及培養(yǎng)，結(jié)果顯示，血培養(yǎng)病原菌檢出率為12.82%，宏基因組測序檢出率為30.77%，將兩種方法檢測結(jié)果分別與Sanger測序法相比，病原菌檢測一致性為81.82%、100%，宏基因組測序法還檢出15 種病毒，該研究表明宏基因組測序在血液感染病原體檢測中具有較高的敏感性、準確性及全面檢測的能力。宏基因組測序作為一種綜合性、定量、敏感性高的檢測方法，在運行過程中能鑒定出耐藥基因，是重癥感染、特殊感染、難以明確診斷的血流感染的理想診斷工具。

2.4 宏基因組測序的其他部位感染中的應(yīng)用宏基因組測序除了在前述系統(tǒng)中運用較多，在其他部位感染性疾病中的運用也有報道。RUPPE 等[47]對24例骨關(guān)節(jié)感染患者的樣本行培養(yǎng)、宏基因組測序，結(jié)果顯示，8例培養(yǎng)為單菌標本中，宏基因組測序病原菌檢出率為100%，抗菌藥物敏感性預(yù)測為94.1%。16例多微生物樣本中，物種水平上，宏基因組測序的靈敏度為58.2%；屬水平上，靈敏度提高到74.5%。宏基因組測序檢測出培養(yǎng)法未發(fā)現(xiàn)的273 種細菌。該研究表明宏基因組測序在骨關(guān)節(jié)感染病原菌檢測中具有較好的運用優(yōu)勢，能在物種水平上鑒定細菌，能同時檢測出多種細菌，檢測敏感性及效率較高，能為治療骨關(guān)節(jié)感染定制抗生素方案。DOAN 等[48]對6例患者眼內(nèi)標本進行宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，3例分別檢測出單純皰疹病毒1型、新生隱球菌、弓形蟲，該結(jié)果被免疫法證實，通過針對病原體的治療，病情均改善；病例4和5 樣本未發(fā)現(xiàn)病原菌，與臨床實際相符合；病例6為16年雙眼慢性葡萄膜炎，PCR 技術(shù)病毒檢測陰性，眼內(nèi)液宏基因組測序發(fā)現(xiàn)風疹病毒，該結(jié)果被Sanger測序證實。該研究表明宏基因組測序可以利用較少的眼內(nèi)液鑒定葡萄膜炎感染病原體，以其獨特的檢測優(yōu)勢成功運用于眼內(nèi)感染病原體檢測，為眼睛感染診治提供一種新的檢測工具。

宏基因組測序已在多個系統(tǒng)感染性疾病病原體檢測中成功運用，可同時檢測感染樣本中的細菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種病原菌，可高效、準確、全面識別病原菌，提高臨床對感染性疾病的早期診斷及治療水平，改善臨床預(yù)后。

3 宏基因組測序在感染性疾病病原體檢測中存在的不足與展望

宏基因組測序技術(shù)越來越受到廣泛的關(guān)注，多篇文獻報道了其在感染性疾病病原體檢測中成功運用，但其運用仍存在一些不足：（1）來自人類宿主細胞，正常微生物菌群和其他來源的富含核酸的樣本存在核酸污染，影響檢測結(jié)果，限制病原體檢測的總體敏感性；（2）臨床樣本中多樣性微生物的存在，使得結(jié)果解釋更加復(fù)雜，目前缺乏統(tǒng)一病原體相對豐度、序列讀數(shù)的界值，難以準確區(qū)分感染、定植及污染；（3）參考數(shù)據(jù)庫不夠完整，甚至包含錯誤信息，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，甚至導(dǎo)致檢測結(jié)果無法分析；（4）測序成本仍較高，檢測費用比許多其他臨床試驗高，限制其廣泛運用；（5）測序生成的大量數(shù)據(jù)在存儲和分析方面存在挑戰(zhàn)，需要大量技術(shù)及專業(yè)知識支持；（6）測序結(jié)果復(fù)雜多樣，缺乏統(tǒng)一的結(jié)果分析標準和對報告解釋的通用指南。所以，宏基因組測序尚不能取代傳統(tǒng)的診斷方法，但可以作為一種補充測試，在常規(guī)檢測法無法揭示診斷、重癥感染或免疫功能嚴重受損的患者，可作為最后的手段來嘗試識別感染過程。

宏基因組測序彌補傳統(tǒng)病原體檢測法的局限性，以無偏移采樣，識別已知的和罕見的病原體，甚至發(fā)現(xiàn)新的病原體，允許對這些病原體進行物種級別的鑒定，通過測序讀數(shù)的計數(shù)，提供各種病原菌濃度的定量或半定量數(shù)據(jù)，有利于在多微生物樣品中精確鑒定病原菌，對各個系統(tǒng)感染鑒定均有較好的運用價值，在以后的研究中，需進一步確定標準、規(guī)范的操作流程，制定結(jié)果分析指南，通過技術(shù)升級及改進降低檢測成本，完善參考數(shù)據(jù)庫信息，期待宏基因組測序技術(shù)在感染性疾病診治中更深入、廣泛的使用，在耐藥基因及藥敏檢測中有所突破，進一步提高感染性疾病的精準診治能力。