白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

柏海濤 陳文兵 劉歡

膿毒癥(sepsis)是臨床常見的急危重癥，急性肝損傷( acute liver injury，ALI)是膿毒癥最早見的靶器官損傷[1]，炎癥因子的大量激活是膿毒癥患者器官損傷的主要機(jī)制，急性肝損傷也與炎癥因子的過度激活密切相關(guān)[2]，抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)肝功能在膿毒癥的治療中已經(jīng)被證實[3]。核因子 κB( nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路是膿毒癥炎癥因子激活釋放的主要調(diào)節(jié)通路[4]，白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是多酚類化合物，主要來源于花生 、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗炎、抗氧化的作用，可以作為動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑[5]。本研究觀察白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，并探討NF-κB炎性通路在其中的可能作用。

資料與方法

一、實驗材料和方法

健康雄性SD大鼠購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，體質(zhì)量210 ～ 240 g，共 40只，在動物中心清潔級適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行后續(xù)實驗造模和研究。

二、方法

(一)膿毒癥造模 40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)和造模組(30只)，盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)制作膿毒癥大鼠實驗?zāi)Ｐ?。簡述如下：備皮消毒后?0 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1.5 cm切口，找到盲腸，游離腸系膜，距盲腸末端1/3處用 4 號手術(shù)線結(jié)扎，穿刺盲腸腸管，將盲腸還納腹腔，關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射生理鹽水抗休克治療。10只假手術(shù)組大鼠僅僅分離盲腸，不做結(jié)扎和穿孔。術(shù)后30只造模SD 大鼠隨機(jī)分為膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組，每組15只，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠于術(shù)后60 min尾靜脈注射無菌白藜蘆醇(40 mg/kg，美國sigama公司產(chǎn)品)，假手術(shù)組和膿毒癥模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

(二)外周血總膽紅素(TBil)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的ELISA法檢測

大鼠外周血TBil、AST、ALT、TNF-α、IL-6表達(dá)使用ELISA法檢測。ELISA檢測試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司(批號：20180514、20180418、20180522、20180407、20180523)，造模前和造模24 h后抽取大鼠尾靜脈血液0.4 mL，交由檢驗科嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，加入相關(guān)試劑，上海巴玖實業(yè)有限公司SAF-680T酶標(biāo)儀檢測各樣品的吸光度值變化，對照標(biāo)準(zhǔn)品，計算各樣品TBil、AST、ALT、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

(三)肝組織細(xì)胞細(xì)胞核P65的Western blot檢測 造模24 h后，所有大鼠均斷頸處死，取50 mg肝組織，液氮下研磨后，PBS洗滌2次，細(xì)胞核蛋白提取CelLyticTMNuCLEARTM試劑盒購自美國sigma公司(批號：20180422)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞核蛋白，加入蛋白裂解液，取10 μg核蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入兔抗鼠P65抗體(購自上?？党缮锕こ逃邢薰?，批號：201800317)孵育12 h，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(購自美國sigma公司，批號：201800226)，化學(xué)發(fā)光后使用Quantity One V4.3.0軟件，掃描條帶，以組蛋白為內(nèi)參計算各樣品的相對表達(dá)量。

三 、統(tǒng)計分析

選用SPSS 18. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用t檢驗，多組均數(shù)比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、三組造模后存活率比較

假手術(shù)組無大鼠死亡，存活率為100.0%，膿毒癥模型組死亡6只，存活9只，存活率為60.0%，白藜蘆醇干預(yù)組死亡4只，存活11只，存活率為73.3%，三組間存活率具有顯著性差異(P<0.05)。

二、三組大鼠肝功能指標(biāo)的比較

造模前三組TBil、AST和ALT表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)，造模24 h后假手術(shù)組TBil、AST和ALT無顯著性變化(P>0.05)，膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組TBil、AST和ALT均顯著升高(P<0.01)，但白藜蘆醇干預(yù)組TBil、AST和ALT均顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。見表1。

三、三組大鼠TNF-α、IL-6表達(dá)的比較

假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組造模前外周血TNF-α和IL-6表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，造模24 h后假手術(shù)組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組(P<0.01)，白藜蘆醇干預(yù)組TNF-α和IL-6表達(dá)又顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。見表2。

四、三組造模24 h后肝組織細(xì)胞細(xì)胞核P65的表達(dá)

肝組織細(xì)胞核P65相對灰度值在假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組為0.22±0.05、0.48±0.11、0.34±0.07，各組間具有顯著性差異(P<0.01)。其中假手術(shù)組肝組織細(xì)胞細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組，白藜蘆醇干預(yù)組又顯著低于膿毒癥模型組。

討 論

膿毒癥激發(fā)的全身炎癥綜合征是伴發(fā)多器官功能障礙的重要原因[6]，研究已發(fā)現(xiàn)膿毒癥急性肝損傷患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的激活[7]，NF-κB信號通路是機(jī)體內(nèi)一條重要的炎性調(diào)節(jié)通路[8]，在膿毒癥時處于激活狀態(tài)，并且可以參與到肝損傷的致病過程中，李徽徽等[9]的實驗研究顯示抑制NF-κB信號通路可以對抗大鼠膿毒癥導(dǎo)致的急性肝損傷。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，其抗炎作用已被大多數(shù)實驗所證實[10]，研究顯示白藜蘆醇可以顯著降低氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，對急性肝損傷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用[11]。本研究也觀察到了白藜蘆醇干預(yù)組肝功能指標(biāo)顯著低于膿毒癥模型組，說明了膿毒癥時給予白藜蘆醇對模型鼠肝組織具有保護(hù)作用。

表1 三組TNF-α和IL-6表達(dá)的比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01；與膿毒癥模型比較,▲▲P<0.01。造模24h后與造模前比較,##P<0.01

表2 三組TNF-α和IL-6表達(dá)的比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01；與膿毒癥模型比較,▲▲P<0.01。造模24 h后與造模前比較,##P<0.01

NF-κB信號通路中的主要效應(yīng)蛋白是P65和P50，二者形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)下游炎性因子例如TNF-α和IL-6 等的表達(dá)，因此研究中檢測細(xì)胞核中P65蛋白的表達(dá)就可以反應(yīng)出NF-κB信號通路的激活情況[12]。本研究的檢測顯示模型組大鼠肝組織細(xì)胞核P65表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，其中白藜蘆醇干預(yù)組肝組織細(xì)胞細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于非干預(yù)的膿毒癥模型組，說明了白藜蘆醇抑制了NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白P65的核移位，下游的炎癥因子TNF-α和IL-6也相應(yīng)的在白藜蘆醇干預(yù)組顯著低于膿毒癥模型組。綜合上述研究提示了白藜蘆醇對膿毒癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來實現(xiàn)的，但是其具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步實驗來證實。