四川石渠縣牦牛源蜱感染斑點(diǎn)熱群立克次體分子流行病學(xué)調(diào)查

劉城成，唐天才，塔 英，林寶山，袁東波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，陽(yáng)愛(ài)國(guó)，郝力力，李 銳

斑點(diǎn)熱群立克次體 (spotted fever group rickettsia, SFGR) 屬于立克次體目(Rickettsiales) 、立克次體科 (Rickettsiaceae) 、立克次體屬(Rickettsia)，是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性原核微生物，多數(shù)為人獸共患病病原體，其引起的立克次體病在世界各地均有發(fā)生。人感染立克次體的病例在歐洲[1]、美洲[2]、澳洲[3]等國(guó)家均有報(bào)道，在我國(guó)的新疆[4]、黑龍江[5]、河南[6]等地區(qū)也從人體內(nèi)分離到了具有致病性的立克次體。四川省石渠縣(35°58′ 50.77″N, 98°06′10.58″E)是隸屬于四川省甘孜州的純牧業(yè)縣，位于青藏高原東南緣，境內(nèi)平均海拔4 200 m，轄區(qū)面積25 191 km2。牦牛是當(dāng)?shù)刂饕募倚?，由于?jīng)濟(jì)發(fā)展相對(duì)滯后以及傳統(tǒng)生活方式等因素影響，養(yǎng)殖方式粗放，驅(qū)蟲(chóng)意識(shí)淡薄，牦牛體表蜱蟲(chóng)寄生嚴(yán)重。由于當(dāng)?shù)啬撩裨诜拍吝^(guò)程中與牦牛接觸頻繁，增加了感染相關(guān)蜱傳病的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)該地區(qū)蜱種類以及斑點(diǎn)熱群立克次體流行狀況的研究均為空白。因此，本研究以牦牛體表寄生蜱為研究對(duì)象開(kāi)展調(diào)查，以期掌握當(dāng)?shù)仳绲姆N類及其斑點(diǎn)熱群立克次體感染的情況，為該地區(qū)蜱傳病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蜱采集 于2018年3-8月從石渠縣麻甲鄉(xiāng)、德榮瑪鄉(xiāng)、阿日扎鄉(xiāng)及長(zhǎng)須干瑪鄉(xiāng)的牦牛體表采集蜱，裝入收集管，塞入潮濕脫脂棉，放入75%酒精溶液中，并置于4 ℃冰箱保存待檢。

1.1.2主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)、Trans 2K Plus DNA maker、2x EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金公司)、1xTAE溶液、瓊脂糖、引物合成、測(cè)序均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(成都公司)完成。

1.1.3主要器材 電泳儀電源(DYY-6C型)購(gòu)于北京六一儀器廠,Leica S9D體式顯微鏡購(gòu)于中輝徠博(北京)儀器有限公司,臺(tái)式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型) 購(gòu)于南京學(xué)靜生物科技有限公司,Bio-Rad伯樂(lè)梯度PCR擴(kuò)增儀(PTC240型)購(gòu)于南京學(xué)靜生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1蜱形態(tài)分類 根據(jù)《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志》[7]，采用體式顯微鏡對(duì)蜱初步進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定后選取每個(gè)地點(diǎn)不同種類蜱的20%進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，最終確定種類。

1.2.2DNA提取 取出用75%酒精保存的樣品，無(wú)菌水洗滌晾干后延縱向中軸線切割，分別裝入EP管，半只于-80 ℃冰箱凍存，另外半只于玻璃研磨器中研碎。采用EasyPure Genomic DNA Kit按照說(shuō)明書提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR檢測(cè) 蜱及斑點(diǎn)熱群立克次體的分子鑒定分別采用郭麗萍[8]和Oteo、Fernández de Mera[9-10]建立的方法，引物見(jiàn)表1。兩種引物擴(kuò)增均采用25 μL的反應(yīng)體系，2x EasyTag PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL混勻。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(Rickettsia slovaca DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存)和陰性對(duì)照(去離子水)。蜱16S rRNA基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫；立克次體ompA基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫；立克次體ompB基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min; 16 ℃保溫。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

表1 PCR引物
Tab.1 PCR primers

鑒定物種引物序列(5'-3')靶基因 產(chǎn)物大小 /bp參考文獻(xiàn)蜱Tick16S+1:CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCGG16S-1:CCGGTCTGACAGATCAAGT16S rRNA460[10]立克次體Rr190.70p:ATGGCGAATATTTCTCCAAAAompA530 [11]Rickettsia sppRr190.602n:AGTGCAGCATTCGCTCCCCCTompB-F:GGGTGCTGCTACACAGCAGAAompB618[12]ompB-R:CCGTCACCGATATTAATTGCC

1.2.4序列分析及統(tǒng)計(jì)分析 陽(yáng)性樣品送生工測(cè)序，所得序列用DNA Star軟件進(jìn)行拼接分析，在NCBI中blast進(jìn)行比對(duì)，再應(yīng)用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并用SPSS軟件中pearson卡方檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蜱采集數(shù)量及形態(tài)鑒定 在石渠縣4個(gè)鄉(xiāng)共采集到蜱818只，分別是長(zhǎng)須干瑪鄉(xiāng)234只，麻甲鄉(xiāng)224只、德榮瑪鄉(xiāng)192只及阿日扎鄉(xiāng)168只，經(jīng)鑒定，青海血蜱172只，西藏革蜱646只，形態(tài)特征分別如圖1、圖2所示。

A為青海血蜱背面；B為青海血蜱腹面圖1 青海血蜱形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis

A為西藏革蜱背面；B為西藏革蜱腹面圖2 西藏革蜱形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus

2.2蜱16S rRNA基因擴(kuò)增與遺傳進(jìn)化分析 以提取的蜱組織DNA為模板，擴(kuò)增蜱16S rRNA基因片段，均出現(xiàn)目的條帶，部分樣本片段大小約430 bp，與預(yù)期相符。蜱16S rRNA基因序列經(jīng)拼接、比對(duì)后共得7條，其中4條屬于西藏革蜱，3條屬于青海血蜱，分別命名為D.everestianus.shiqu1-4、H.qinghaiensis.shiqu1-3。選取BLAST比對(duì)后同源性最高的序列1-2條以確定種，即青海血蜱和西藏革蜱，再選取不同地點(diǎn)分離到的青海血蜱和西藏革蜱的16S rRNA序列，最后選取部分不同種類的血蜱和革蜱的16S rRNA序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖3所示，4個(gè)革蜱分離株與西藏的西藏革蜱(KJ599809、KJ599803)親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)98.83%～98.89%。血蜱分離株則與甘肅臨洮(MF629859)、甘肅永靖(MF629848)同源性最高，達(dá)99.08%～99.31%；與青海湟源(MF629882)同源性達(dá)98.33%～98.83%。

圖3 基于16S rRNA基因蜱種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ticks based on 16S rRNA gene

2.3立克次體ompA、ompB基因PCR擴(kuò)增 以提取的蜱組織DNA為模板，擴(kuò)增立克次體ompA、ompB基因片段，長(zhǎng)須干瑪鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖4所示，ompA基因片段大小約530 bp，ompB基因片段大小約618 bp，與預(yù)期相符。

2.4立克次體PCR檢測(cè)結(jié)果 立克次體檢測(cè)結(jié)果如表2所示，在818只蜱中，有408只蜱檢測(cè)到斑點(diǎn)熱群立克次體，感染率為49.8%(408/818)，選擇100個(gè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)，其中未定種的立克次體約5%，勞氏立克次體約95%。在4個(gè)調(diào)查點(diǎn)中，德榮瑪鄉(xiāng)感染率最高，達(dá)58.3%, 其余依次是麻甲53.5%、長(zhǎng)須干瑪44.4%及阿日扎鄉(xiāng)42.8%。德榮瑪鄉(xiāng)蜱斑點(diǎn)熱群立克次體感染率高于其他3個(gè)調(diào)查點(diǎn)(χ2=7.175，P<0.05)。在麻甲鄉(xiāng)青海血蜱斑點(diǎn)熱群立克次體的感染率高于西藏革蜱(χ2=6.216，P<0.05)。

M：DL 5000 marker；1：陽(yáng)性對(duì)照；2-9：蜱樣本；10：陰性對(duì)照?qǐng)D4 長(zhǎng)須干瑪鄉(xiāng)部份樣本ompA、ompB基因PCR反應(yīng)后電泳圖Fig.4 PCR products of ompA and ompB gene of some samples in Changxuganma Village

表2 石渠縣蜱立克次體PCR檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
Tab.2 Detection results of ticks-borneRickettsiain Shiqu County

調(diào)查點(diǎn)樣本數(shù)陽(yáng)性數(shù)感染率青海血蜱西藏革蜱合計(jì)青海血蜱西藏革蜱合計(jì)青海血蜱(%)西藏革蜱(%)合計(jì)(%)阿日扎0168168072720.0042.842.8麻甲172522241002012058.138.453.5*德榮瑪019219201121120.0058.358.3長(zhǎng)須干瑪023423401041040.0044.444.4合計(jì)17264681810030840858.1*47.649.8

*P<0.05。

2.5立克次體ompA、ompB基因遺傳進(jìn)化分析 將立克次體ompA基因序列拼接、比對(duì)后共得4條序列(約530 bp)，分別命名為UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4有31個(gè)堿基的差異；R.raoultii.shiqu2與R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有1個(gè)堿基差異；R.raoultii.shiqu3與R.raoultii.shiqu4僅有1個(gè)堿基差異。將其與GenBank中已有勞氏立克次體ompA基因進(jìn)行同源性比較并且選取不同種類立克次體的ompA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)種系親緣關(guān)系進(jìn)行分析。如圖5所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與我國(guó)青海未定種的unculturedRickettsiasp.(MG228270)同源性達(dá)100%，與分離自韓國(guó)的長(zhǎng)角立克次體CandidatusRickettsialongicornii(MG906676)同源性為98.21%，兩者有9個(gè)堿基差異；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4與分離自意大利的Rickettsiaroutliiz164(MH532249)、分離自我國(guó)北京的IM16株(KY474554)和分離自我國(guó)黑龍江Rickettsiaroutlii(JX885458)聚于同一分支，同源性為98.80%～99.39%；其中R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu4與我國(guó)西藏分離到的RickettsiaroutliiLYG32(JQ792137)同源性分別為99.6%、99.8%，R.raoultii.shiqu3與其同源性達(dá)100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3與RickettsiaroutliiWYG68(JQ792162)同源性為99.80%，R.raoultii.shiqu4與其同源性達(dá)100%。

圖5 基于ompA基因立克次體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompA gene

將立克次體ompB基因序列拼接、比對(duì)后共得4條序列(約618 bp)，分別命名為UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4,其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4存在32個(gè)堿基差異；R.raoultii.shiqu2與R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有1個(gè)堿基差異；R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4僅有一個(gè)堿基差異，將其與GenBank中已有勞氏立克次體ompB基因進(jìn)行同源性比較并且選取不同種類立克次體的ompB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)種系親緣關(guān)系進(jìn)行分析。如圖6所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1與韓國(guó)分離到未定種的Rickettsiasp.(KC888953)和CandidatusRickettsialongicornii(MG906675)同源性達(dá)100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4與在俄國(guó)分離到的哈巴洛夫斯克株Rickettsiaraoultiistrain Khabarovsk(DQ365798)同源性分別為99.47%、99.31%、99.48%；與分離自意大利的Rickettsiaraoultiiz164(MH532272)同源性分別為99.30%、99.13%、99.31%。

圖6 基于ompB基因立克次體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompB gene

3 討 論

本次調(diào)查中4個(gè)鄉(xiāng)均采集到西藏革蜱，而青海血蜱只在麻甲鄉(xiāng)采集到。每種蜱都有特定的生存環(huán)境，西藏革蜱主要生存于我國(guó)西藏和尼泊爾海拔3 500～4 500 m以上的高山荒漠地區(qū)，青海血蜱主要生存于我國(guó)青海海拔2 000～4 200 m的草叢灌木[7]。就海拔和地理位置而言，阿日扎、長(zhǎng)須干瑪及德榮瑪位于雅礱江流域亞寒帶純牧區(qū)，海拔在4 300～4 600 m；麻甲鄉(xiāng)位于金沙江河谷寒溫帶半農(nóng)牧區(qū)，海拔為3 799 m，兩區(qū)的海拔高度存在明顯的差異，這很可能是只在麻甲鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)青海血蜱的主要原因。

在斑點(diǎn)熱群立克次體的鑒定中，依據(jù)Fournie[11]建立的判定標(biāo)準(zhǔn)，ompA基因是斑點(diǎn)熱群立克次體的特異性蛋白基因，如檢出了ompA基因則可以判定為斑點(diǎn)熱群立克次體，如沒(méi)有，則判定斑點(diǎn)熱群立克次體必須符合下列4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的中的兩項(xiàng)：與16S rRNA同源性>98.8%、gltA同源性>92.7%、ompB同源性>85.8%、geneD同源性>82.2%。這是本研究以ompA及ompB基因作為靶基因檢測(cè)斑點(diǎn)熱群立克次體的依據(jù)。檢測(cè)結(jié)果表明該地區(qū)蜱中斑點(diǎn)熱群立克次體的感染率為49.8%。值得注意的是，在麻甲鄉(xiāng)采集到青海血蜱的數(shù)量明顯多于西藏革蜱，并且青海血蜱勞氏立克次體的感染率(58.1%)顯著高于西藏革蜱(38.4%)。

在本研究中，陽(yáng)性樣本中勞氏立克次體占比高，勞氏立克次體于1999年首次分離自革蜱和扇頭蜱，根據(jù)基因庫(kù)中的信息，目前至少在19種蜱中檢測(cè)到勞氏立克次體，包括草原革蜱、短小扇頭蜱、嗜群血蜱、全溝硬蜱、鈍眼螺旋蜱和亞洲璃眼蜱等革蜱屬的蜱更多見(jiàn)攜帶勞氏立克次體[12]，但目前尚無(wú)關(guān)于西藏革蜱感染勞氏立克次體的數(shù)據(jù)。本課題首次在西藏革蜱中檢出了勞氏立克次體DNA，并且有很高的檢測(cè)陽(yáng)性率。攜帶勞氏立克次體的血蜱主要有長(zhǎng)角血蜱、短墊血蜱、草原血蜱[13]。在本次調(diào)查中，青海血蜱的勞氏立克次體感染率為58.1%遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高悅等[14]的檢出率(14.9%(11/74))。此次調(diào)查的陽(yáng)性樣本中有5.0%為未定種立克次體Uncultured Rickettsia sp. shiqu 1，后期我們將應(yīng)用諸如多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)等方法在種的水平上進(jìn)一步鑒定。

2015―2016年，內(nèi)蒙古、河南、山東省報(bào)道有26人感染勞氏立克次體[15]，從其中2例患者的血液中檢測(cè)到并分離到勞氏立克次體哈巴洛夫斯克株R. raoultii strain Khabarovsk，該致病株與本次在石渠縣牦牛體表寄生蜱中檢測(cè)到的勞氏立克次體具有很高的同源性。因此，在石渠縣西藏革蜱和青海血蜱勞氏立克次體高感染率的情況下，是否當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)其也具有一定的感染率有必要開(kāi)展進(jìn)一步的調(diào)查。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)首次對(duì)石渠縣牦牛體表寄生的蜱蟲(chóng)種類及斑點(diǎn)熱群立克次體流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明該地區(qū)青海血蜱和西藏革蜱是當(dāng)?shù)貍鞑谑狭⒖舜误w的重要媒介，并且首次鑒定出西藏革蜱也是攜帶勞氏立克次體的蜱種之一。石渠縣蜱立克次體較高的感染率極大增加了人感染的風(fēng)險(xiǎn)，后期應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)蜱蟲(chóng)的控制及勞氏立克次體流行情況的監(jiān)測(cè)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：劉城成，唐天才，塔英，等. 四川石渠縣牦牛源蜱感染斑點(diǎn)熱群立克次體分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):50-55. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.183