三仁湯對脾胃濕熱型大鼠NLRP3、Caspase-1蛋白的影響＊

彭林佳，刁建新，薛文秀，藍(lán)惠璇，謝俊雄，韓嘉璐，曾宇喬，文小敏

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 廣州 510080）

脾胃濕熱證是脾胃系統(tǒng)疾病中常見的證型之一，主要臨床表現(xiàn)為腹脹腹痛、惡心嘔吐等脾胃系癥狀。長期的臨床與實驗研究表明，脾胃濕熱證型中胃黏膜細(xì)胞病理改變存在著十分密切的關(guān)系。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡的激活主要以Caspase-1 為核心，NLRP3 與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白結(jié)合，形成炎性小體并激活Caspase-1，Caspase-1 介導(dǎo)細(xì)胞因子、炎癥因子的活化，最終形成“瀑布效應(yīng)”、“級聯(lián)效應(yīng)”，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致劇烈的炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。[1-6]中藥復(fù)方三仁湯出自清代吳鞠通《溫病條辨》，主治濕熱流連三焦，暑溫夾濕，濕重于熱的癥候，具有清利濕熱，宣暢氣機的作用。本文建立脾胃濕熱證大鼠模型，用三仁湯進行治療，并監(jiān)測NLRP3 與Caspase-1 蛋白表達(dá)水平，旨在揭示脾胃濕熱證大鼠胃黏膜是否發(fā)生細(xì)胞焦亡，三仁湯可能通過影響大鼠NLRP3、Caspase-1 蛋白的表達(dá)而影響細(xì)胞焦亡。中醫(yī)認(rèn)為，肝膽主氣機的升發(fā)與疏泄，脾主升清，胃主降濁，同居中焦，共同斡旋氣機的升與降。脾的運化有賴于肝氣的條達(dá)，肝能藏血，脾能統(tǒng)血。而肝的疏泄、藏血又需脾胃化生精微來供養(yǎng)。如果脾胃運化功能失常，中焦氣機不運，脾胃對谷食、水蝕運化吸收不好，濕濁就會內(nèi)生，失于升清和降濁。氣機壅塞同樣會波及肝膽，使肝膽疏泄不利而出現(xiàn)脅肋疼痛，膽汁分泌不暢逆行反流，甚至出現(xiàn)黃疸。一般對于急性肝衰竭的研究局限于肝臟本身，但是根據(jù)中醫(yī)的理論，脾胃疾病同樣能夠影響肝臟的功能，故本文通過研究三仁湯可能通過影響大鼠NLRP3、Caspase-1 蛋白的表達(dá)而影響細(xì)胞焦亡，從而為探討脾胃濕熱證與急性肝衰竭的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼養(yǎng)

購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的SPF 級雄性SD 大 鼠50 只，體 質(zhì) 量（200 ± 20）g，合 格 證 號:4402102032，飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境內(nèi)，室溫20-24℃，濕度55%-65%，自由飲水和攝食；高糖高脂飼養(yǎng)。

1.1.2 中藥制備

三仁湯出自中醫(yī)經(jīng)典《溫病條辨》，組成包括苦杏仁15 g，法半夏15 g，生飛滑石18 g，薏苡仁18 g，白蔻仁6 g，川厚樸6 g，白通草6 g，淡竹葉6 g，于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中藥房購買，并經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥鑒定室鑒定，按傳統(tǒng)方法將中藥加水720 mL（按現(xiàn)代藥理學(xué)方法，煎藥水量是中藥質(zhì)量的8 倍）浸泡30 min，武火煮沸，文火再煎煮40 min，連續(xù)兩次，去渣合并，依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[7]中人與大鼠劑量換算公式（大鼠按每只200 g 體質(zhì)量計算），低溫濃縮成高中低三個濃度，分別為16.4 g·kg-1、8.2 g·kg-1、4.1 g·kg-1，4℃冰箱保存。

1.1.3 試劑與菌種

蘇木素、伊紅、磷酸鹽緩沖液、抗Actin 多克隆抗體、抗兔二抗、抗鼠二抗均購于北京中杉金橋生物試劑有限公司；抗兔NLRP3、Caspase-1 多克隆抗體購于美國abcam公司。總蛋白提取及定量試劑盒購于美國Pierce 公 司，ECL 發(fā) 光 液 購 于 美 國Merck Millipore 公司。由南方醫(yī)科大學(xué)微生物實驗室提供，濃度為1X 109n/ml的侵襲性大腸桿菌。

1.1.4 實驗儀器

德國萊卡石蠟切片機，PL303型梅特勒電子天平，日本尼康Eoipse Ti-s 熒光倒置顯微鏡及分析軟件，美國Thermo 全波段酶標(biāo)儀，Bio-Rad 公司轉(zhuǎn)膜儀及PVDF膜。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模

將50只SPF級雄性SD大鼠隨機分成5組，分別為正常對照組、脾胃濕熱模型組、三仁湯低、中、高劑量組，每組10 只。造模組大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。除正常對照組，其它各組給予肥甘飲食飼料（在普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜）喂養(yǎng)10天。然后置于仿真模擬氣候倉（環(huán)境設(shè)置為：溫度33 ± 2℃，相對濕度（75 ± 5）%，每天干預(yù)2 小時）共8 天。第19 天開始按10 mL·kg-1給予大腸桿菌（109 CFU·mL-1）1 次灌胃，24 h 后再加強感染1 次（5mL·kg-1），移出置于自然環(huán)境，建立脾胃濕熱證大鼠模型。病理確認(rèn)以后，給予三仁湯高、中、低劑量，分別給以16.4 g·kg-1、8.2 g·kg-1、4.1 g·kg-1濃度的三仁湯灌胃，連續(xù)灌胃7天。

1.2.2 標(biāo)本獲取

大鼠處死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.35 mL·100 mg-1腹腔注射麻醉，迅速打開腹腔。①腹主動脈采血，3000 r·min-1，離心15 min，-80℃保存。②取胃組織分成2分，1份凍存于-80℃冰箱，進行后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，另一份保存于4%多聚甲醛溶液，進行后續(xù)的病理切片染色。

1.2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察

取胃組織，用10%甲醛固定，按照常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4μm 的厚度，60℃烤片，進行蘇木精-伊紅染色。每只大鼠胃組織制作1 張切片，隨機選取5 個高倍鏡視野進行觀察。應(yīng)用Nikon Eoipse Ti-s 倒置顯微鏡分析圖像。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)量

秤取50 mg 胃組織, 按Pierce 總蛋白提取說明操作進行蛋白裂解，BCA 法進行蛋白定量，取蛋白50μg，在12% SDS-PAGE 電泳, 然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（Millipore 公司），5%脫脂牛奶置于搖床室溫孵育1 h，分別加入抗兔NLRP3、Caspase-1 多克隆抗體（1：1000稀釋）、兔抗小鼠Actin 抗體（1：1000 稀釋），4℃孵育過夜，TBS-T 洗3 次，每次5 分鐘。加入HRP 標(biāo)記的抗兔二抗（1:2000 稀釋）和HRP 標(biāo)記的抗小鼠二抗（1:2000稀釋），置于4℃冰箱孵育1 h，TBS-T 洗滌3 次，每次5分鐘。將膜用ECL 化學(xué)發(fā)光液孵育1 min 后曝光，并用Kodak 2000MM 圖像工作站成像，以NLRP3、Caspase-1 光密度值與Actin 光密度值的比值表示NLRP3、Caspase-1的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多樣本均數(shù)比較采用One-Way ANOVA 方差分析，組間多重比較若符合方差齊性檢驗時用LSD法，計量資料以（±s）表示，若方差不齊則用TamhaneT2法。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三仁湯對脾胃濕熱消化病病理結(jié)果

觀察三仁湯對脾胃濕熱消化病病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脾胃濕熱大鼠病理炎癥細(xì)胞滲出，胃腺體脫落、減少、萎縮，具有壞死和凋亡的特征，同時出現(xiàn)細(xì)胞膜失去完整性的形態(tài)學(xué)特征，即細(xì)胞焦亡的病理特征。另外，三仁湯（高、中、低劑量）組的胃黏膜細(xì)胞焦亡有所改善，鏡下可見胃黏膜炎癥細(xì)胞滲出減少，胃腺體脫落情況相對改善，數(shù)量與模型相比明顯增多，胃黏膜腺體萎縮的情況也有好轉(zhuǎn)。（見下圖）

2.2 三仁湯對脾胃濕熱相關(guān)消化病NLRP3、Caspase1蛋白的影響

通過免疫印跡對NLRP3、Caspase-1 進行定性與定量的測量，可以發(fā)現(xiàn)三仁湯高、中、低劑量組的NLRP3 與Caspase-1 的表達(dá)與模型組相比均有所下降。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

中藥復(fù)方三仁湯出自清代吳鞠通《溫病條辨》，原文上篇第43 條云:“頭痛惡寒，身重疼痛，舌白不渴，脈弦細(xì)而濡，面色淡黃，胸悶不饑，午后身熱，狀如陰虛，病難速愈，名曰濕溫。汗之則神昏、耳聾，甚則目瞑不欲言，下之則洞泄，潤之則病深不解，長夏深秋冬日同法，三仁湯主之?！狈街谢鍩崂麧穸馐?；薏苡仁淡滲利濕以健脾，使?jié)駸釓南陆苟?；白豆蔻芳香化濕，利氣寬胸，暢中焦之脾氣以助祛濕；杏仁宣利上焦肺氣；通草、竹葉甘寒淡滲，助滑石利濕清熱之效；半夏、厚樸行氣除滿，化濕和胃。[8]主治濕熱留戀三焦，暑溫夾濕，濕重于熱的證候，具有清利濕熱，宣暢氣機的作用。古代醫(yī)家對于脾胃濕熱證的論述始于秦漢時期?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》論述了脾、胃與濕、熱邪之間的關(guān)系，并未將濕熱與脾胃直接聯(lián)系起來。古代醫(yī)家對于脾胃濕熱的進一步認(rèn)識在晉隋宋元時期，《諸病源候論·卷三十》云：“口吻瘡候，足太陰為脾之經(jīng)，其氣通于口。足陽明為胃之經(jīng)，手陽明為大腸之經(jīng)，此二經(jīng)脈交并于口。其腑臟虛，為風(fēng)邪濕熱所乘，氣發(fā)于脈，與津液相搏，則生瘡”。[9]脾胃濕熱的理論在明清時期得到完善?！冻嗨椤ぞ硎弧吩疲骸笆肿愫鼓似⑽笣駸醿?nèi)郁所致，脾胃主四肢”。[10]現(xiàn)代藥理學(xué)研究與臨床實踐證明表明，三仁湯具有治療急性胃腸炎、慢性萎縮性胃炎、消化不良、急慢性腹痛等作用。[11-22]脾胃濕熱證在臨床上主要表現(xiàn)為中上腹脹、噯氣、呃逆、反酸等癥狀。本實驗HE 染色結(jié)果顯示，模型組胃黏膜活動性炎癥，胃黏膜充血、水腫和潰瘍，胃腺體萎縮、減少、脫落，細(xì)胞膜失去完整性的形態(tài)學(xué)特征，脾胃濕熱型大鼠可能發(fā)生了細(xì)胞焦亡，引起了炎癥的爆發(fā)，從而引起慢性胃炎，通過用三仁湯高、中、低劑量和奧美拉唑進行干預(yù)，與模型組相比，胃黏膜炎癥細(xì)胞的滲出明顯減少，胃黏膜腺體方面，腺體明顯增多、萎縮情況減少的。與奧美拉唑組相比，三仁湯高、中、低劑量組胃黏膜炎癥與胃黏膜腺體情況也是有所改善的，這表明三仁湯對于脾胃濕熱證有著明顯的改善作用。

細(xì)胞焦亡是目前研究得較為熱門的細(xì)胞壞死模式，其顯著特征之一為細(xì)胞膜完整性明顯喪失，并釋放胞漿中促炎性細(xì)胞內(nèi)容物，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。[6]細(xì)胞焦亡是由一系列能形成炎性小體的模式識別受體所觸發(fā)，這些模式識別受體包括NOD 樣受體NLRP1、NLRP3 等，它們通過識別同源配體的方式與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白結(jié)合，形成一個大分子復(fù)合物，趨化Caspase-1 形成炎性小體，并激活Caspase-1，成熟的Caspase-1促進炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。[2,6,23-25]細(xì)胞焦亡最突出的特點是依賴于Caspase-1 的激活，這種依賴于Caspase-1 的細(xì)胞死亡方式稱為經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡。[26]Caspsae-1 是細(xì)胞焦亡過程極為重要的關(guān)鍵蛋白。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Caspase-1 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是由一系列能形成炎性小體的模式識別受體所觸發(fā)。這些模式識別受體包括NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）NLRP1、NLRP3 和NLRC4/NAIP 及黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）等，它們通過識別同源配體的方式與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）結(jié)合，形成一個大分子復(fù)合物，趨化Caspase-1 形成炎性小體，并激活Caspase-1，成熟的Caspase-1 促進白細(xì)胞介素1β（interleukin 1-β，IL-1β）和白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）的成熟，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，炎性體（inflammsome）的形成是細(xì)胞焦亡的一個重要特征。[1-2,23,27-31]研究表明，細(xì)胞焦亡在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的推動作用。[25,32-46]本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，三仁湯高、中、低劑量組下調(diào)脾胃濕熱證大鼠胃黏膜NLRP3、Caspase-1 蛋白的表達(dá)，脾胃濕熱大鼠引起的細(xì)胞焦亡，可能受到NLRP3、Caspase-1蛋白的調(diào)控。

綜上所述，三仁湯可能通過下調(diào)脾胃濕熱大鼠的NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)，減少胃粘膜細(xì)胞焦亡，從而抑制胃粘膜炎癥的爆發(fā)，從而防治脾胃濕熱證模型大鼠，為臨床治療脾胃濕熱證的胃痛提供了理論依據(jù)。