填精通絡方對糖尿病性勃起功能障礙大鼠組織RhoA/Rho信號通路相關(guān)因子表達的影響＊

于旭東，劉蕊嘉，王繼升，鄧 省，鮑丙豪，商建偉

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 北京 100700）

1 研究背景

勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED），是指在性行為過程中陰莖無法達到或維持足夠良好的勃起[1]。本病不僅使患者性功能低下，而且降低其生活質(zhì)量，同時也是心血管疾病的預警信號。隨著當前社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，中青年一代壓力與日俱增，流行病學調(diào)查顯示，糖尿病（Diabetes mellitus，DM）患者的ED 發(fā) 病 率 達 到35%-90%[2]，是 非DM 人 群 的1.9-4倍[3-5]。糖尿病性勃起功能障礙（Diabetes-induced erectile dysfunction，DIED）的發(fā)病是一個復雜的病理生理學過程，涉及血管內(nèi)皮功能、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變等多因素。其中陰莖海綿體血管平滑肌舒張能力的下降被認為是引起勃起功能障礙的關(guān)鍵因素之一。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)平滑肌的收縮能力也是決定陰莖勃起功能的重要因素，其中代表性的信號通路RhoA/Rho是當前研究熱點之一。

當前對于DIED 的治療方法主要包括口服PED-5抑制劑、假體植入、負壓吸引等，然而這些治療手段都具有一定的副作用和局限性，口服PED-5 抑制劑類藥物治標難治本，存在依賴性強、易復發(fā)等不足之處，外科手術(shù)治療的適應癥有限，且療效一直備受爭議[6]。中醫(yī)藥治療DIED 有一定療效，中醫(yī)理論認為DIED 最主要的病機是腎虛血瘀，因此，填精通絡方在臨床一線中具有良好的應用效果，該方由仙靈脾、熟地、水蛭、川牛膝組成。仙靈脾和熟地補腎養(yǎng)血，填精益髓，水蛭和川牛膝活血通經(jīng)逐瘀?，F(xiàn)代中藥藥理學研究表明，這些藥物具有改善血管內(nèi)皮功能、修復內(nèi)皮損傷的功效[7-8]。因此，本研究以陰莖海綿體血管平滑肌的收縮功能為切入點，觀察填精通絡方治療DIED 模型大鼠勃起功能的療效及其對RhoA/Rho 信號通路的影響，探索填精通絡方的部分機制。

2 材料和方法

2.1 藥物和試劑

實驗所需藥物主要包括造模藥物和實驗干預藥物，其中造模使用的鏈脲佐菌素（STZ）和阿樸嗎啡（APO）從中國上海Sigma-Aldrich 公司統(tǒng)一購置。實驗干預所用陽性對照藥他達拉非從Eli Lilly and Company購入，溶解后在適宜環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 中藥的制備

所用中藥顆粒來自北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院（中國北京）。填精通絡方的藥物組成包括：熟地黃10g、仙靈脾15g、川牛膝10g、水蛭10g。制備工藝：中藥飲片經(jīng)單味提取、濃縮、干燥、制粒而成顆粒型，具體單味藥顆粒型的制備工藝流程由北京同仁堂有限公司統(tǒng)一進行，填精通絡方將已加工成顆粒狀的相應藥物按比例調(diào)配在一起完成中藥的制備。質(zhì)量標準：顆粒劑的質(zhì)量標準由東直門醫(yī)院藥物質(zhì)檢部門統(tǒng)一檢驗合格后購入。顆粒劑購入后制備為溶解液將顆粒溶于蒸餾水中，濃度為700 mg/kg 灌胃，溶解后在適宜環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 動物和治療

2.3.1 動物

SPF 級成年雄性SD 大鼠，8 周齡，體重（230±50）g，購自北京維通利華驗動物科技有限公司（合格證號NO.SYXK（京）2012-0001，北京，中國）。大鼠在標準的實驗室條件下飼養(yǎng)，提供標準食物和水。北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院動物與人類倫理委員會批準了這項研究。

2.3.2 建立DIED大鼠模型

SD 大鼠禁食12 小時用STZ 溶液以腹腔注射的方式進行DIED 大鼠模型的建立。72 小時后，第1 周和第2周各從大鼠的尾靜脈取血檢測即時血糖水平。每次的檢測結(jié)果>16.7 mmol/L，同時記錄各組大鼠每日排尿情況和飲食情況，兩者較前均增加則表明造模成功。根據(jù)Heaton的方法[9]，將DM大鼠稱重并放置在透明的玻璃箱中，光線暗到僅供觀察，房間保持安靜。在適應環(huán)境15分鐘后，每只大鼠在頸部皮膚松弛處注射APO100 μg/kg 并觀察30 分鐘。陰莖增大，包皮回縮，龜頭陰莖充血，陰莖末端出現(xiàn)稱為陰莖勃起。如果勃起次數(shù)≥1，則認為勃起試驗陽性。血糖> 16.7 mmol/L且勃起試驗陰性的大鼠為DIED造模成功。

2.3.3 治療

實驗大鼠進行5 天的適應性喂養(yǎng)，之后隨機選擇10 只作為正常組，其余進行DIED 造模。其余造模成功的大鼠分為三組：模型組（DIED 組）（n=10）、對照組（他達拉非組）（n10）和填精通絡組（n=10）。在隨后的4周中，對照組的大鼠每天灌胃0.2 mg/kg他達拉非，填精通絡組大鼠通過灌胃每天灌胃9.3 g/kg 填精通絡中藥。對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水。每周稱量大鼠，每天觀察它們的健康狀況。

2.4 勃起功能評估

藥物干預4 周后，對各組大鼠陰莖勃起次數(shù)和勃起潛伏時間進行測試。具體方法是每只大鼠皮下注射APO，記錄30分鐘內(nèi)勃起次數(shù)和勃起潛伏期。如果沒有勃起，潛伏期記為30分鐘。

2.5 組織的制備

治療結(jié)束后稱重大鼠并用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹膜內(nèi)）麻醉。從每只大鼠取出陰莖組織并用冷鹽水洗滌并用10%布因氏溶液固定24小時。脫水后，石蠟包埋，4-5μm 切片，蘇木精和伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察HE 染色的載玻片（BK-FL4，OPTEC，重慶，中國）。

2.6 Western Boltting

為檢測RhoA、ROCK1和ROCK2，取出每只大鼠的海綿體組織的一部分，在冰冷的組織裂解緩沖液中勻漿。將混合物以12000 rpm 離心10 分鐘后收集上清液。使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，用RIPA 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度并煮沸5 分鐘。每個樣品用10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。稀釋比例分別為RhoA（1∶300）、ROCK1（1∶300）和ROCK2（1∶300）（BIOSS，北京，中國）。以βactin 作為內(nèi)參（ImmunoWay Biotechnology Company，USA）進行免疫印跡，4℃水平搖床孵育過夜。第二天將二抗稀釋后在室溫下孵育30分鐘，使用ECL檢測系統(tǒng)（Millipore，USA）檢測免疫反應信號。

表1 靶基因的實時PCR引物序列

表2 各組大鼠治療后勃起行為的比較

2.7 PCR檢測RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA

用Trizol（TaKaRa Biotechnology，大連，中國）將海綿體組織勻漿。使用RNA 樣品的OD260/OD280 比率評估RNA的質(zhì)量。根據(jù)制造商的說明使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa Biotechnology，Dalian，China）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。靶基因的實時PCR 引物序列如表1。

使用DNA 結(jié)合染料SYBRGreen 通過ABI 7500 系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA，USA）進行cDNA 的擴增。使用GAPDH 作為內(nèi)部參照基因，并使用2-ΔΔCt 方法評估RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA表達的變化。

2.8 統(tǒng)計分析

所有來自本研究的計量數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果表示為平均值± 標準偏差。若數(shù)據(jù)符合正太分布，各組間采用獨立樣本t檢驗；不滿足正態(tài)分布情況下，若滿足方差齊性，則使用單因素方差分析（ANOVA）分析組間差異，若不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗法，P<0.05表示差異顯著。

表3 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol/L，±s）

表3 各組大鼠治療前后血糖比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P<0.01；與他達拉非組比較，#P<0.01

組別正常組模型組他達拉非組填精通絡組n 10 10 10 10治療前4.3±0.3 22.1±1.9 23.5±2.0 23.7±1.6治療后4.2±0.4 23.6±2.2 24.8±1.0 18.8±1.3*#

3 結(jié)果

3.1 填精通絡方對各組SD大鼠勃起行為的影響

結(jié)果如表2、圖1 顯示，與模型相比，對照組（他達拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡組陰莖勃起次數(shù)顯著增加，潛伏期縮短（P<0.01 和P<0.05）。對照組和填精通絡組之間沒有顯著差異。

3.2 填精通絡方對各組SD大鼠血糖的影響

實驗結(jié)果表明，填精通絡方能明顯降低大鼠血糖水平。填精通絡組治療后血糖均顯著低于治療前血糖（P < 0.01）。與模型組比較，填精通絡組的血糖明顯降低（P<0.01）；與他達拉非組比較，填精通絡組的血糖明顯降低（P<0.01）。實驗結(jié)果見表3。

3.3 填精通絡方對DIED大鼠組織病理學的影響

圖1 各組大鼠治療后勃起行為的比較

圖2 各組大鼠陰莖海綿體HE染色結(jié)果（×40；×100，n=3）

正常組陰莖海綿竇毛細血管豐富，呈網(wǎng)狀交織，未見明顯的陰莖海綿體間隔，可見大量不規(guī)則血竇間隙，血竇、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、間質(zhì)組織及微血管腔結(jié)構(gòu)清晰，血竇間隙表面附有扁平的內(nèi)皮細胞，血竇小梁含有大量平滑肌細胞及膠原纖維。模型組（DIED 組）陰莖海綿體間隔明顯，陰莖海綿體血竇、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞分布雜亂，陰莖海綿體平滑肌細胞數(shù)量減少，血管內(nèi)皮細胞連續(xù)性破壞，膠原纖維密度增加，間質(zhì)組織大量增生、排列紊亂，血管壁增厚，呈纖維樣變，管腔變小或閉塞，提示血管破壞，紅細胞數(shù)目減少，同時可見結(jié)締組織增生，如箭頭所指部位細胞連續(xù)性受到破壞，排列紊亂。對照組（他達拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡組（REDCF 組）陰莖海綿體血管中紅細胞數(shù)目較模型組增多，但結(jié)締組織差異不明顯，病理變化介于兩者之間，如箭頭所指部位對照組與填精通絡組治療后組織結(jié)構(gòu)較模型組改善明顯，見圖2。

3.4 填精通絡方對DIED 大鼠RhoA，ROCK1 和ROCK2 mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR 檢測海綿體相關(guān)基因mRNA表達水平見圖3。與空白組相比，模型組（DIED 組）、對照組（他達拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡組（REDCF 組）RhoA，ROCK1 和ROCK2 的mRNA 水平顯著 升 高（P < 0.01 和P < 0.05）。與DIED 組 相 比，Tadalafil 組 和REDCF 組RhoA，ROCK1 和ROCK2 mRNA 的 表 達 顯 著 降 低（P < 0.01 和P < 0.05）。Tadalafil組與REDCF組之間無顯著差異。

3.5 填精通絡方對DIED 大鼠RhoA，ROCK1 和ROCK2蛋白表達的影響

如圖4 所示，本研究發(fā)現(xiàn)對照組（他達拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡組（REDCF 組）的RhoA，ROCK1 和ROCK2 蛋白水平低顯著低于模型組（DIED組）（P < 0.01 和P < 0.05）。RhoA 蛋白水平高于對照組（P < 0.01）。對照組（他達拉非組/Tadalafil 組）和填精通絡組（REDCF 組）之間RhoA，ROCK1 和ROCK2蛋白表達無顯著性差異。

4 討論

圖3 各組大鼠RhoA，ROCK1和ROCK2 mRNA表達水平

圖4 各組大鼠RhoA/Rho信號通路相關(guān)蛋白表達水平

腎精虧虛、脈絡瘀阻貫穿DIED 發(fā)生發(fā)展的始終，在治療上以補腎活血、填精通絡為主要原則。辨證施治的時需在補腎活血，填精通絡的前提下，再根據(jù)不同的證型具體的臨證加減藥物及其用量?！皻鉃檠畮洠獮闅庵??！睔馓搫t難以推動血行，導致氣虛血瘀，脈絡瘀阻。使得宗筋不得氣血之濡養(yǎng)，則發(fā)為陽痿。所謂“腎虛必致血瘀，瘀血必歸于腎”，是因為血瘀脈絡而導致腎精化生不暢。因此，DIED 在治療上應以補腎活血，填精通絡為主要的治療方法，腎精得補，瘀血得散才能使得腎中精氣化生有源，宗筋得以氣血濡養(yǎng)，方能起痿。

臨床上，本研究發(fā)現(xiàn)填精通絡方在治療DIED 上有著良好的效果，不僅能過改善患者勃起功能，還能明顯輔助降低患者血糖。研究表明DIED 的嚴重情況和血糖控制情況是密切的，DIED 的治療是以控制血糖為基礎的，防止糖尿病對血管、神經(jīng)的進一步損害。本實驗結(jié)果表明，填精通絡組治療后血糖均顯著低于治療前血糖，但血糖降低的幅度并不大，可見在治療DM的時候，還是其他輔助方式來治療DM。

目前，在實驗研究方面，ED 的研究主要集中在海綿體和血管平滑肌舒張功能的減弱上。實際上，良好的陰莖勃起還取決于收縮功能。在松弛狀態(tài)下，海綿體和血管平滑肌的收縮是主要的；而在勃起狀態(tài)下，其松弛是主要的。陰莖必須首先克服平滑肌的收縮力才能完全勃起。因此，海綿體和血管平滑肌收縮功能增強也是誘導ED 發(fā)生的重要機制[10-11]。2001 年，Chitaley 等[9]首次發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體組織中表達內(nèi)源性Rho 激酶（ROCK）。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶途徑參與DIED 發(fā)生[12-13]。該通路中的RhoA 是一種小分子的GTP 結(jié)合蛋白，屬于Ras 相關(guān)的Rho 家族，主要以非活化的狀態(tài)與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate,GDP）結(jié)合，是無活性的GDP 與活性的GTP 的分子開關(guān)。Rho 激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有兩種亞型：ROCK1、ROCK2，它們可以增高胞漿內(nèi)Ca2+濃度，使胞漿中的Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，活化肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），使其磷酸化，導致肌球蛋白和肌動蛋白發(fā)生交聯(lián)，最終引起平滑肌的收縮[14-15]。同時，RhoA/Rho 激酶通路可通過抑制eNOS 的磷酸化從而減少NO的產(chǎn)生，進而減弱平滑肌的舒張功能。

本實驗所采用的STZ注射造模，是經(jīng)典的DIED造模方法。根據(jù)前期研究基礎，本實驗選用50 mg/kg 的注射量，造模階段STZ 造模組與造?？瞻讓φ战M比較逐漸出現(xiàn)明顯多尿、多飲、多食、體重下降現(xiàn)象，體毛逐漸枯黃，無光澤，反應逐漸遲鈍，這與中醫(yī)的“消渴”病癥狀相符；同時，對DM 大鼠使用APO 篩選后，成功選取勃起功能障礙大鼠，成功構(gòu)建DIED 大鼠模型。本實驗所采用的陽性對照藥物他達拉非是PDE5 抑制劑之一，臨床廣泛用于治療ED。研究證實PDE5-Is對Rho/ROCK 通路有影響。PDE-5 抑制劑可能通過幾種生物學機制改善癥狀，包括Rho 相關(guān)蛋白激酶失活的改變[16]。故本研究選擇了他達拉非作為陽性對照藥物。

從實驗結(jié)果可以看出，第一，本研究可以得出結(jié)論：STZ 造模的DIED 大鼠RhoA/Rho 激酶表達增加。第二，根據(jù)勃起行為的結(jié)果，填精通絡方和他達拉非干預后勃起功能增強。第三，填精通絡方治療改善了陰莖海綿體的形態(tài)學改變。第四，經(jīng)填精通絡方干預后，RhoA、ROCK1 和ROCK2 的表達顯著下降，可認為填精通絡方改善DIED 大鼠勃起功能的機制之一可能是下調(diào)RhoA/Rho 激酶的表達。而且，根據(jù)DIED 組的結(jié)果，本研究可以發(fā)現(xiàn)他達拉非還具有降低RhoA/Rho通路的蛋白表達的功效。先前的研究已證實PDE5-Is對Rho/ROCK 通路有影響，這與實驗結(jié)果一致，并且此研究進一步證明了RhoA，ROCK1 和ROCK2 參與介導該過程。在勃起時，RhoA/Rho 通路被抑制，從而引起海綿體平滑肌舒張增強和收縮減弱。相反地，RhoA/Rho通路的激活抑制海綿體平滑肌的舒張功能并促進收縮功能，最終導致勃起功能障礙[17]。因此，RhoA/Rho蛋白的高表達意味著平滑肌舒張功能的下降與收縮能力的增強，也就是勃起功能的減弱。

5 結(jié)論

本實驗的研究結(jié)果表明，填精通絡方改善了由STZ構(gòu)建的DIED 大鼠的勃起功能，其作用機制可能是下調(diào)RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白在RhoA/Rho 通路中的表達，為RhoA/Rho 成為治療DIED 的新靶點提供重要依據(jù)。