飼料中預(yù)添加不同水平?；撬釋?duì)熱應(yīng)激虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

■羅志成 康玉軍 劉 哲* 權(quán)金強(qiáng) 秦 勇

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省漁業(yè)技術(shù)推廣總站，甘肅蘭州730070）

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)，屬硬骨魚(yú)綱(Osteich?thyes)，鮭形目(Salmoniformes)，鮭科(Salmonidae)，適宜生長(zhǎng)水溫為12～18 ℃[1]，是一種冷水性魚(yú)類(lèi)。其對(duì)溫度變化具有一定耐受能力，超過(guò)范圍將造成魚(yú)體損傷甚至死亡[2]。研究表明高溫應(yīng)激對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、攝食以及代謝等方面影響較大[3]。目前，關(guān)于虹鱒熱應(yīng)激研究已較為普遍，大量研究表明熱應(yīng)激前后虹鱒血清及組織中抗氧化指標(biāo)、抗損傷指標(biāo)及熱應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)差異顯著[4]。本課題組發(fā)現(xiàn)24 ℃是虹鱒熱應(yīng)激的“一個(gè)關(guān)鍵高溫點(diǎn)”，該溫度點(diǎn)可能是虹鱒由適應(yīng)性調(diào)節(jié)進(jìn)入“受損”的臨界點(diǎn)[5-6]；25 ℃時(shí)虹鱒肝臟等組織損傷已較為嚴(yán)重[7]。目前關(guān)于如何提高虹鱒抗熱應(yīng)激的能力，已成為廣大研究人員的重大課題。

?；撬幔?-氨基乙磺酸，是動(dòng)物體內(nèi)含量最為豐富的非蛋白游離氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物各個(gè)組織和重要器官中[8]。1827 年首次從公牛膽汁中分離出來(lái)，具有廣泛的生理功能，如維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，提高機(jī)體抗氧化能力和免疫能力，抗細(xì)胞凋亡等[9]。目前關(guān)于?；撬嵩趧?dòng)物生產(chǎn)中的研究已較為廣泛，研究發(fā)現(xiàn)，添加外源牛磺酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、非特異性免疫能力具有一定的提升作用[10-11]，且在畜禽動(dòng)物上研究發(fā)現(xiàn)，外源?；撬峋哂懈纳茻釕?yīng)激肉雞(Gallus gallus domesticus)腸道免疫性能、減輕和保護(hù)熱應(yīng)激引發(fā)的輸卵管損傷[12-13]，但目前關(guān)于牛磺酸在虹鱒上的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)選擇?；撬嶙鳛樘砑觿?8 ℃條件下提前投喂不同水平的?；撬犸暳?，30 d 后進(jìn)行慢性高溫應(yīng)激試驗(yàn)，比較分析高溫應(yīng)激后虹鱒血清生化指標(biāo)的變化規(guī)律，為研制虹鱒抗熱應(yīng)激添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

選用北京漢業(yè)科技有限公司市售商品化虹鱒膨化浮性顆粒飼料為基礎(chǔ)飼料，其主要成分包括魚(yú)粉、豆粕、小麥粉、玉米蛋白粉、魚(yú)油、復(fù)合維生素、復(fù)合微量元素等，其營(yíng)養(yǎng)成分含量：粗蛋白(40.0%)、粗脂肪(12.0%)、粗灰分(14.0%)、粗纖維(5.0%)、賴(lài)氨酸(2.2%)、水分(12.0%)、總磷(0.9%)，基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)成分含量由北京漢業(yè)科技有限公司提供。將基礎(chǔ)飼料粉碎過(guò)40 目篩，采用逐級(jí)擴(kuò)大混合法分別在基礎(chǔ)飼料中添加0、600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg ?；撬?北京奧博星，含量≥98.0%)，充分混合后制成2 mm 顆粒料，自然晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

虹鱒由甘肅省張掖市冷水魚(yú)良種繁育中心提供，挑選個(gè)體均勻、健康無(wú)傷虹鱒450 尾，初始體重為(203.26±2.01) g，隨機(jī)分成3 組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)投放50 尾，分別飼養(yǎng)在大小一致的養(yǎng)殖槽(250 cm×120 cm×100 cm)中，試驗(yàn)在甘肅省張掖市冷水魚(yú)良種繁育中心進(jìn)行。所選試驗(yàn)魚(yú)先用基礎(chǔ)飼料在18 ℃條件下暫養(yǎng)1 周，然后分別投喂不同水平的牛磺酸飼料，投喂量為虹鱒體重的3%，分別在8:00、14:00 和19:00 進(jìn)行投喂，每次投喂完成30 min 后，觀察攝食情況并統(tǒng)計(jì)殘餌量，最后用虹吸管吸取每缸糞便，避免水質(zhì)污染，飼養(yǎng)期間光照周期12 h 光照/12 h 黑暗，試驗(yàn)水為地下微流水(單位面積注水量0.1 m3/m2·h，平均水交換率為0.17 次/h)。每日進(jìn)行常規(guī)的水質(zhì)指標(biāo)監(jiān)測(cè)：溶氧量(9.5±0.5) mg/l，氨氮濃度(0.10±0.05) mg/l，水溫利用深圳市安晟電子有限公司生產(chǎn)的數(shù)顯溫度計(jì)(CX-WDJ200LCD)測(cè)量，溶氧量和氨氮濃度利用杭州陸恒生物有限公司溶解氧檢測(cè)試劑盒和氨氮檢測(cè)試劑盒測(cè)定。18 ℃條件下飼養(yǎng)30 d 后進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)。模擬自然升溫的方法，利用鍋爐和加熱棒進(jìn)行升溫，使養(yǎng)殖槽的水溫從18 ℃開(kāi)始緩慢上升，嚴(yán)格控制水溫使每日升高1 ℃，7 d 后養(yǎng)殖槽水溫達(dá)到25 ℃。期間光照周期12 h 光照/12 h 黑暗。每日進(jìn)行常規(guī)的水質(zhì)指標(biāo)監(jiān)測(cè)：溶氧量(9.5±0.5) mg/l，氨氮濃度(0.15±0.05) mg/l。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)魚(yú)在24、25 ℃條件下24 h后采樣。每組隨機(jī)挑選3尾，快速轉(zhuǎn)入MS-222(50 mg/l)中深度麻醉，尾靜脈采血，血液置于4 ℃靜置2 h，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min 制備血清，收集血清用液氮速凍，并置于超低溫冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

取每組血清樣品各3 份，按照白蛋白(albumin，ALB)試劑盒(A028-1)、總蛋白(total protein，TP)試劑盒(A045-3)操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定ALB 和TP 含量，按照總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)試劑盒(A001-1)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(A007-1)、丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)試 劑 盒(A003-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxi?dase，GSH-Px)試劑盒(A005)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)試劑盒(C010-1)、溶菌酶(lysozyme，LZM)試劑盒(A050)操作說(shuō)明測(cè)定T-SOD、CAT、MDA、GSH-Px、AST、LZM 活性[球蛋白(globu?lin，GLO)含量(g/l)=TP 含量-ALB 含量]。所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其中吸光度值利用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(UNICO UV-3802)測(cè)定，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS Statistics 19.0 中One-way ANOVA和Duncan's法進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(X±SD)表示，n=3，P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒抗氧化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表1）

表1 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒抗氧化指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激條件下虹鱒血清中抗氧化酶活性隨預(yù)添加?；撬崴阶兓?guī)律如表1 所示，同一溫度點(diǎn)下，虹鱒血清中T-SOD、CAT、GSH-Px 活性隨?；撬釢舛鹊脑黾映尸F(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。24 ℃時(shí)，1 200.0 mg/kg ?；撬峤M虹鱒血清中T-SOD、CAT、GSH-Px 活性高于其他組，相比于0 mg/kg 組，酶活性分別增加了32.44%、12.36%、30.84%，差異顯著(P＜0.05)；25 ℃時(shí)，1 200.0 mg/kg?；撬峤M虹鱒血清中CAT、GSH-Px 活性高于其他組，相比于0 mg/kg 組，酶活分別增加了13.79%、27.96%，差異顯著(P＜0.05)。

2.2 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒血清蛋白含量的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒血清蛋白含量的影響

熱應(yīng)激條件下虹鱒血清蛋白含量隨預(yù)添加?；撬崴阶兓?guī)律如圖1 所示，同一溫度點(diǎn)下，牛磺酸添加組虹鱒血清中TP、ALB 含量均顯著升高(P＜0.05)。24 ℃時(shí)，600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg 牛磺酸組虹鱒血清中ALB含量相比于0 mg/kg組分別提高了18.91%、10.52%，差異顯著(P＜0.05)，TP 含量相比于0 mg/kg 組分別提高了10.57%、6.17%，差異顯著(P＜0.05)。25 ℃時(shí)，600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg 牛磺酸組虹鱒血清中ALB 含量相比于0 mg/kg 組分別提高了13.39%、16.13%，差異顯著(P＜0.05)，TP 含量相比于0 mg/kg 組分別提高了9.13%、11.02%，差異顯著(P＜0.05)。

2.3 預(yù)添加不同水平?；撬釋?duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒血清其它血清酶活性的影響(見(jiàn)圖2、圖3)

熱應(yīng)激條件下虹鱒血清中LZM 活性隨預(yù)添加?；撬崴阶兓?guī)律如圖2 所示，同一溫度點(diǎn)下，虹鱒血清中LZM 活性隨?；撬釢舛鹊脑黾映尸F(xiàn)逐漸增大的變化趨勢(shì)。24 ℃時(shí)，600.0、1 200.0 mg/kg?；撬峤M虹鱒血清中LZM 活性相比于0 mg/kg 組分別增加了6.41%、7.45%(P＞0.05)；25 ℃時(shí)，600.0、1 200.0 mg/kg?；撬峤M虹鱒血清中LZM活性相比于0 mg/kg組分別增加了8.43%、11.35%(P＞0.05)。

圖2 預(yù)添加不同水平?；撬釋?duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒LZM活性的影響

圖3 預(yù)添加不同水平?；撬釋?duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒AST活性的影響

熱應(yīng)激條件下虹鱒血清中AST 活性隨預(yù)添加牛磺酸水平變化規(guī)律如圖3 所示，相比于未添加組，添加了牛磺酸的虹鱒在水溫達(dá)到24 ℃和25 ℃時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有所降低，且差異顯著。24 ℃時(shí)，600.0、1 200.0 mg/kg ?；撬峤M虹鱒血清中AST 活性相比于0 mg/kg 組 分 別 降 低 了19.54%、30.15%(P＜0.05)；25 ℃時(shí)，600.0、1 200.0 mg/kg ?；撬峤M虹鱒血清中AST 活性相比于0 mg/kg 組分別降低了18.82%、24.13%(P＜0.05)。

3 討論

3.1 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒抗氧化能力的影響

虹鱒是典型的冷水性魚(yú)類(lèi)，對(duì)高溫環(huán)境異常敏感，其生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)極易受到高溫的影響。大量研究表明熱應(yīng)激前后，機(jī)體抗氧化指標(biāo)、激素指標(biāo)、非特異性免疫指標(biāo)等均會(huì)發(fā)生較大變化[14-15]。與機(jī)體抗氧化能力相關(guān)的酶主要包括T-SOD、CAT、GSH-Px 等，其活性和含量的高低直接反映了機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[16]。

T-SOD 是動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一種金屬抗氧化酶(Mn-SOD、CuZn-SOD)，可催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫(H2O2)和水，從而消除異常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，24 ℃時(shí)?；撬崽砑咏M虹鱒血清中T-SOD活性顯著高于0 mg/kg組，說(shuō)明在飼料中添加適量的?；撬釋?duì)虹鱒體內(nèi)TSOD的合成具有較好的調(diào)節(jié)作用，這種改善可能與?；撬釁⑴c合成體內(nèi)多種調(diào)節(jié)酶有關(guān)，具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。向梟等[18]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加800.0 mg/kg的牛磺酸，鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)SOD活性顯著提升。王清濱[19]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加1 200.0 mg/kg 的?；撬幔蒴~(yú)(Ctenopharyngodon idel?lus)SOD活性顯著提高。說(shuō)明不同動(dòng)物?；撬徇m宜劑量存在差異，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)、個(gè)體規(guī)格不同有關(guān)。

CAT 是生物體內(nèi)的非常重要的抗氧化防御性功能酶，可有效清除T-SOD 歧化超氧陰離子時(shí)產(chǎn)生的H2O2，并防止H2O2反應(yīng)生成有害的羥自由基，較高的CAT 活性代表了機(jī)體具有較強(qiáng)的H2O2清除能力。本研究發(fā)現(xiàn)，同一溫度點(diǎn)下，1 200.0 mg/kg ?；撬崽砑咏M虹鱒血清中CAT 活性顯著高于0 mg/kg組，說(shuō)明在飼料中添加適量的?；撬峥捎行嵘琪V血清中CAT 活性。類(lèi)似規(guī)律王清濱[19]在草魚(yú)的研究中同樣被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明適量的?；撬崮芴岣咚a(chǎn)動(dòng)物消除H2O2的能力，可能是因?yàn)榕；撬釁⑴c虹鱒抗氧化相關(guān)酶的關(guān)鍵反應(yīng)，加速了機(jī)體對(duì)抗氧化酶的合成能力。

GSH-Px 是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)中一種較為重要的分解H2O2的酶，能將有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)動(dòng)物機(jī)體免受自由基的干擾和損傷。胡金宇等[20]研究發(fā)現(xiàn)400.0 mg/kg 的?；撬峥娠@著提升小鼠(Mus musculus)血清和組織中GSH-Px 活性。本研究發(fā)現(xiàn)，同一溫度點(diǎn)下?；撬崽砑咏M虹鱒血清中GSH-Px 活性顯著高于0 mg/kg 組，說(shuō)明在飼料中添加適量的?；撬峥捎行嵘琪V血清中GSH-Px 活性，可能是因?yàn)橥庠磁；撬岬臄z入，對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)酶的合成與分泌能力具有促進(jìn)作用。

MDA 是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終分解產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量的多少可以間接反映自由基含量的多少以及組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)24 ℃水溫已對(duì)虹鱒機(jī)體產(chǎn)生損傷，且通過(guò)對(duì)相關(guān)血清生化指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，該溫度條件下血清中MDA 含量相較于18 ℃顯著提高。本研究中發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激條件下各?；撬峤M虹鱒血清中MDA 含量雖無(wú)顯著差異，但?；撬崽砑咏M虹鱒血清中MDA 含量均低于0 mg/kg組，說(shuō)明預(yù)添加?；撬釋?duì)虹鱒肝臟等組織的抗氧化能力起到一定的提升作用，可能是因?yàn)榕；撬峋哂蟹€(wěn)定細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的能力，其具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

3.2 預(yù)添加不同水平牛磺酸對(duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒血清蛋白含量的影響

血清中TP 由ALB 和GLO 組成，其含量反映了機(jī)體代謝和營(yíng)養(yǎng)狀況[21]。ALB是血液中含量最多、功能較復(fù)雜的一種蛋白，能平衡機(jī)體滲透壓，對(duì)維持機(jī)體正常的生理功能具有重要意義；GLO 的含量影響機(jī)體免疫狀態(tài)，同時(shí)對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)的運(yùn)輸也有一定的影響[22]。本研究發(fā)現(xiàn)同一溫度下，?；撬崽砑咏M虹鱒血清中ALB 和TP 含量顯著高于0 mg/kg 組，說(shuō)明?；撬釋?duì)虹鱒體內(nèi)蛋白質(zhì)的吸收和合成具有較好的調(diào)節(jié)作用，原因可能是?；撬釁⑴c機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)合成路徑中相關(guān)反應(yīng)，通過(guò)一定的調(diào)節(jié)作用從而提高虹鱒血清中ALB 和TP 的含量，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 預(yù)添加不同水平?；撬釋?duì)熱應(yīng)激條件下虹鱒其它血清酶的影響

魚(yú)類(lèi)血液的生化指標(biāo)與機(jī)體的代謝、健康狀況密切相關(guān)；當(dāng)魚(yú)類(lèi)生理狀態(tài)良好時(shí)，生化指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定；但當(dāng)魚(yú)體受到外界因素刺激時(shí)，生化指標(biāo)便會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化；因此，魚(yú)類(lèi)生化指標(biāo)可以為了解魚(yú)體健康狀況提供重要參考。LZM是一種堿性蛋白水解酶，能消滅革蘭氏陽(yáng)性菌，主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中，是魚(yú)類(lèi)非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分[23]。目前，許多研究水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫功能時(shí)常用血清LZM活性表示，LZM 活性提高，其免疫能力也相應(yīng)提高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激條件下，牛磺酸添加組虹鱒血清中LZM 活性高于0 mg/kg 組，說(shuō)明適量的牛磺酸能提高虹鱒血清中LZM的活性，對(duì)虹鱒的部分非特異性免疫能力具有提升作用；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)25 ℃時(shí)虹鱒血清中LZM活性顯著低于24 ℃，說(shuō)明25 ℃已超過(guò)虹鱒自身的耐受能力，機(jī)體相關(guān)免疫器官已遭受?chē)?yán)重的應(yīng)激損傷，該結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致。

AST是催化α-酮戊二酸反應(yīng)的一種酶，在正常情況下這種酶主要存在于肝臟和腎臟等組織中，血清中的含量非常少，當(dāng)組織受損時(shí)有大量的轉(zhuǎn)氨酶逸入血液，導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，因此可以根據(jù)血清中AST 的活性來(lái)判斷組織是否受到損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激條件下?；撬崽砑咏M虹鱒血清中AST活性相較于0 mg/kg 組均有所降低，說(shuō)明適量的?；撬釋?duì)水產(chǎn)動(dòng)物的抗損傷能力具有一定的提升作用。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激條件下，預(yù)添加1 200.0 mg/kg的?；撬峤M虹鱒抗氧化能力、部分非特異性免疫及抗損傷能力均高于未添加組，說(shuō)明?；撬崮芴岣吆琪V機(jī)體的抗熱應(yīng)激能力，可作為虹鱒抗熱應(yīng)激的備選添加劑，其最適劑量及作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。