飼料中多種雷瑣酸內酯類藥物殘留檢測方法研究

■蔣 慧 程林麗

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193)

雷瑣酸內酯類藥物屬于同化激素中的非甾類雌性激素，主要包括α-玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇(β- ZAL)、玉米赤霉烯酮(ZON）、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)和玉米赤霉酮(ZAN）[1]。具有抗菌、抗瘧疾等作用[2]，能促進蛋白質合成、增重、提高瘦肉率和飼料轉化率[3]，但同時也有致癌、致畸、致突變以及其它潛在的健康安全隱患。目前許多國家已禁止使用該類藥物促進家畜的生長，我國的農業(yè)農村部公告中對于玉米赤霉醇的使用也有了明確規(guī)定[4]，但由于其經濟回報高，違法使用的現(xiàn)象仍然存在，除此之外飼料霉變也可能導致該類藥物的產生。

我國有關飼料中雷瑣酸內酯類藥物的檢測方法標準主要有3個，其中農業(yè)部1486號公告—6-2010規(guī)定了飼料中雷瑣酸內酯類藥物的氣相色譜-質譜檢測方法，檢測限與定量限分別為2 μg/kg 和5 μg/kg[5]。GB/T 19540—2004 規(guī)定了玉米赤霉烯酮的薄層色譜測定方法和酶聯(lián)免疫吸附測定法，最低檢測量分別為為20 μg/kg 和0.25 μg/kg[6]。GB/T 28716—2012 規(guī)定了飼料中玉米赤霉烯酮含量的免疫親和柱凈化高效液相色譜的測定方法，檢測限與定量限分別為2 μg/kg和10 μg/kg[7]。

由于雷瑣酸內酯類藥物與一些其他真菌毒素及藥物等結構相似且在飼料中的含量有可能較低，為了從源頭上解決雷瑣酸內酯類藥物的殘留，對飼料品質進行監(jiān)控，需要采用高準確度和精密度的定性定量方法。而氣相色譜-質譜法(GC/MS)方法正是生物樣品及飼料中雷瑣酸內酯類藥物高準確度和精密度檢測的經典測定方法之一。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Shimadzu GC-2010 Plus 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC/MS），配電子轟擊離子源(EI)，日本Shimadzu 公司；MP2002 型電子天平（感量0.01 g），上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FA1204C 精密電子分析天平（感量0.000 01 g），上海越平科學儀器有限公司；Sep-Pak SiLica 固相萃取裝置，美國Waters 公司；HQ-60-II 渦旋混合器，北方同正生物技術發(fā)展有限公司；SHK-99-Ⅱ臺式空氣恒溫搖床，北方同正生物技術發(fā)展有限公司；TARGIN?VX-Ⅲ多管渦旋震蕩器，北京踏錦科技有限公司；5804R 高速冷凍離心機（可達8 000 r/min，相對離心力為7 012 g），德國Eppen?dorf 公司；DGF25012CN 電熱恒溫干燥箱，上海市躍進醫(yī)療器械一廠；N-Evap112 氮吹儀，美國Or?ganomationAssociates 公司；MiLLi-Q 超純水系統(tǒng)，美國MiLLipore 公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標準品

α-玉米赤霉醇；β-玉米赤霉醇；玉米赤霉酮；α-玉米赤霉烯醇；β-玉米赤霉烯醇；玉米赤霉烯酮，純度均≥99%，均來自美國Sigma公司。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈、甲酸色譜純，水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級水。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

甲醇-水（80+20，v/v）：用量筒分別量取80 ml 甲醇和20 ml水，置于同一玻璃瓶內，搖勻。

乙腈-水（10+90，v/v）：用量筒分別量取10 ml 乙腈和90 ml水，置于同一玻璃瓶內，搖勻。

標準貯備液(100 μg/ml)：用精密電子分析天平分別稱取六種雷瑣酸內酯類藥物各0.01 g（精確到0.000 01 g），并置于100 ml 容量瓶，向其內加入甲醇進行溶解稀釋定容。-20 ℃冰箱中保存3個月。

標準貯備液(1 μg/ml)：取100 μg/ml 雷瑣酸內酯類藥物標準儲備液1 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，4 ℃冰箱中保存1個月。

標準工作液：取適量1 μg/ml 六種雷瑣酸內酯類藥物混合后的標準貯備液，用乙腈稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/ml和1 μg/ml的標準工作液。4 ℃冰箱中保存1周。

1.3.2 采樣和試樣制備

按照相關國家標準，取飼料樣品，采用四分法縮減取約200 g，粉碎后過0.45 mm 孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。用于后續(xù)的藥物提取以及藥物添加回收試驗。

1.3.3 樣品處理

1.3.3.1 提取

稱取5 g 飼料于50 ml 離心管中，加15 ml 甲醇-水（80+20，v/v），蓋好管蓋后可將多個離心管一起置于試管架上以同時在多管渦旋震蕩器上渦旋1 min，之后將試管及試管架一起固定在臺式空氣恒溫搖床上震蕩40 min。8 000 r/min 離心10 min，將上層的提取液快速倒入另一50 ml離心管中，再取15 ml甲醇-水（80+20，v/v）于下層飼料殘渣所在的離心管中，重復震蕩，離心等步驟，之后合并兩次提取液，定容至30 ml，混勻備用。

1.3.3.2 凈化

從上一步驟所得的混合提取液中取3 ml 溶液于10 ml離心管中。加3 ml正己烷，渦動1 min，6 000 r/min離心1 min，之后倒掉上清液。下層用3 ml 正己烷重復洗滌一次。50 ℃水浴中用氮氣吹至1 ml 左右，加入2 ml水充分溶解殘液，為上樣溶液。取固相萃取裝置，將6 cc/500 mg HLB固相萃取柱安裝于其上，依次用5 ml 乙腈和5 ml 水預洗，取3 ml 上樣溶液過柱。之后依次用乙腈-水（10+90，v/v）和水各5 ml 進行淋洗。待溶液全部滴下后抽真空1 min。再用含6%的甲酸乙腈10 ml 洗脫，待溶液全部滴下后抽真空1 min，將洗脫液收集到試管中。50 ℃氮氣吹干（當溶液剩下2 ml左右時，取出，渦動10 s，待殘留于試管上方管壁的藥物重新溶解于溶液中后接著氮吹至干），供衍生化用。同時取500 μl 標準工作液于試管中，50 ℃氮氣吹干，供衍生化用，作為對照標準品。

上樣溶液和洗脫液的流速均控制在1 ml/min 以內。衍生化之前的氮吹過程中一定要盡可能地吹得足夠干，以免影響衍生化效果。

1.3.3.3 衍生化

加衍生化試劑200 μl，渦動溶解，封口膜密封，60 ℃恒溫箱中衍生化15 min，冷卻至室溫后加入300 μl小襯管中供氣相色譜-質譜測定。樣品溶液中藥物濃度超過檢測范圍時用甲苯稀釋后進樣。

1.3.4 測定

1.3.4.1 色譜參考條件

氣相色譜柱：Rtx-5MS，長度：30 m，膜厚：0.25 μm，內徑：0.25 mm?；駾B-5MS 柱等相當者。載氣：氦氣，載氣流速：1.0 ml/min。進樣口溫度：250 ℃。進樣量：1 μl，不分流。柱溫程序：起始120 ℃，以15 ℃/min的速度升至280 ℃，保持5.2 min。

1.3.4.2 質譜參考條件

電子轟擊電離(EI)。電離能量：70 eV。接口溫度：280 ℃。離子源溫度：230 ℃。溶劑延遲：7 min。采集方式：選擇離子檢測（SIM）。開始時間：7 min，結束時間：15.9 min。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

文獻報道的飼料及生物樣品中雷瑣酸內酯類藥物檢測方法的提取劑主要有甲醇、乙酸、乙酸乙酯、甲醇-水（80+20，v/v）、乙腈-水（84+16，v/v）。

試驗結果表明，這些提取溶劑均具有很好的提取效果，但甲醇對少數預混合飼料中的藥物提取率低，乙腈-水（體積比84:16）對某些配合飼料中的藥物提取率低，甲醇-水（體積比80:20）做提取溶劑時的飼料適用范圍最廣，對供試飼料基質中藥物的提取效率均超過了90%，因此最后確定使用它作為提取溶劑。

2.2 提取方法的選擇

文獻報道的相關提取方法主要為渦旋震蕩和/或超聲之后過濾或離心的方法。

農業(yè)部1486 號公告—6-2010 標準方法簡單的采取渦動1 min 和3 600 r/min 離心5 min 的方法，經過兩次提取，藥物提取率相對較低。再此方法的基礎上，本試驗采取渦動1 min 后采用臺式空氣恒溫搖床震蕩40 min的方法，并提取兩次。

2.3 凈化方法的選擇

農業(yè)部1486號公告—6-2010標準方法要經過兩次液液分配、多次氮氣吹干、外加固相萃取小柱凈化過程。整個凈化過程繁瑣，耗時長，樣品前處理過程過于復雜，不利于我國飼料監(jiān)控過程中的時效要求。在該方法的基礎上，我們將HLB 小柱從60 mg 換成500 mg，經過進一步優(yōu)化過柱條件，大大地提高了小柱的凈化效果。因此減除了乙醚-0.1%碳酸鈉洗滌和多次濃縮置換溶劑的步驟，大大地簡化了凈化步驟，將工作量縮減了三分之二，樣品前處理時間縮短了一半。

2.4 質譜條件的優(yōu)化

根據六種藥物的分子結構特征，采取選擇離子檢測模式，參考農業(yè)部1486 號公告—6-2010 的儀器分析條件，對六種雷瑣酸內酯類藥物進行測定。采用Rtx-5MS 毛細管柱代替原來的DB-5MS 分離柱。載氣流速為1 ml/min，進樣口溫度280 ℃，爐溫初始120 ℃，以15 ℃/min 的速率升至280 ℃，并在此溫度下保持5.2 min，色譜時間15.9 min。由于兩種玉米赤霉烯醇在實際樣品的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，m/z536定量比m/z305定量的抗干擾能力更佳，因此采用前者為定量離子。在此條件下，六種雷瑣酸類酯類藥物分離良好。各化合物的定性定量離子見表1。

表1 雷索酸內酯類藥物的定性離子和定量離子(m/z)

2.5 標準曲線

在給定儀器條件下，對0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 μg/ml 和0.5 μg/ml 標準工作液衍生化后進樣分析，以標準溶液的濃度為橫坐標，定量離子的色譜峰峰面積值為縱坐標作標準曲線。測得六種雷瑣酸內酯類藥物的標準曲線圖見圖1，相關方程和線性相關系數見表2。以上結果表明，在0.001～0.5 μg/ml 范圍內，藥物濃度與峰面積呈線性相關。在進行實際樣品的分析時，如果分析物的終濃度不在這個線性范圍，則應該將分析物進行稀釋或濃縮。

圖1 雷瑣酸類酯類藥物標準曲線

2.6 方法的靈敏度

在本試驗條件下，以外標法定量。檢測限以空白樣品中與標準品藥物保留時間相同位置的基線噪聲的3倍值為依據，定量限以空白樣品在標準品保留時間的基線噪聲的10 倍值為依據，測得配合飼料中六種雷瑣酸內酯類化合物的檢測限均為2.0 ng/g，定量限均為5.0 ng/g，能夠滿足飼料中雷瑣酸內酯類藥物的分析需要。

對配合飼料進行5.0 ng/g 的空白添加回收試驗，往空白飼料中添加相應量的標準貯備液，渦動，混勻，使飼料中各化合物的藥物濃度為5.0 ng/g。靜置15 min 以上，按樣品前處理過程進行提取和凈化，衍生化，之后采用氣相色譜質譜法進行分析，結果見表3。各化合物的回收率水平在71%～91%之間，變異系數在1.69%～9.73%之間。該結果表明，定量限添加水平的準確度和精密度均滿足痕量分析方法的要求。

表2 雷索酸類酯類藥物標準曲線方程

表3 5.0 ng/g雷索酸類酯類藥物的空白添加回收結果（n=3）

2.7 方法的準確度和精密度

為考察方法的精密度、準確度數據以及其適用范圍，對配合飼料進行空白添加回收試驗。稱取5 g 空白飼料，往其內添加相應量的標準貯備液，對六種藥物設0.01、0.1、2.0 μg/g 三個添加水平。每個水平設4 個重復。渦動，混勻，靜置15 min以上，按樣品前處理過程進行提取和凈化，經衍生化后采用氣相色譜質譜儀進行分析。添加回收結果如表4 所示。在這些不同的飼料和不同的藥物添加水平上，各個藥物的添加回收率范圍均在80%～94%之間，變異系數均小于12%。由此結果可知，對飼料中此六個化合物分析的準確度和精密度均符合飼料中污染物檢測和飼料藥物添加劑檢測的方法要求。

3 討論

本試驗在參考文獻的基礎上，通過對提取溶劑、提取條件、凈化方法、以及儀器檢測條件的選擇與調整，對飼料中雷瑣酸內酯類藥物的氣相色譜-質譜檢測方法進行了優(yōu)化。采用甲醇-水（80+20，v/v）為提取液，正己烷除脂（正己烷萃取，然后除去正己烷層，可以幫助除去脂類而不影響目標物回收）和6cc/500 mg HLB固相萃取柱凈化，經過衍生化試劑BSTFA+TMCS(99+1)衍生化，之后采用氣相色譜質譜儀進行分析，外標法定量。該方法的準確性、精密度和靈敏度均達到我國對飼料中雷瑣酸內酯類藥物檢測的要求。與農業(yè)部1486 號公告—6-2010 方法比較減少了操作步驟和溶劑的使用，大大節(jié)約了檢測時間，提高了檢測效率。與農業(yè)部1486 號公告—6-2010 方法的詳細比較見表5。

表4 添加回收率和變異系數（n=4）

表5 本方法與農業(yè)部1486號公告—6-2010方法的對照

4 結論

該檢測方法，對六種雷瑣酸內酯類藥物檢測限均為2.0 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg，在0.01、0.1、2.0 μg/g 添加水平下，平均回收率為80%～94%之間，變異系數均小于12%，能夠滿足飼料中雷瑣酸內酯類藥物的分析需要。且與農業(yè)部1486 號公告—6-2010方法比較實驗流程更方便快速，更適合大批量日常分析檢測。