含血小板反應(yīng)蛋白18型基序的解聚素樣金屬蛋白酶在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能

姜業(yè)臻, 陳雙江

(1.陜西省西安市北環(huán)醫(yī)院 外一科, 陜西 西安, 710032;2.陜西省安康市人民醫(yī)院 普通外科, 陜西 安康, 725000;3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科, 陜西 西安, 710061)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤[1], 具有惡性程度高、進(jìn)展速度快等特點(diǎn)，目前治療效果欠佳[2]。含血小板反應(yīng)蛋白的解聚素樣金屬蛋白酶(ADAMTS)是一類具有鋅離子依賴性的分泌型基質(zhì)金屬蛋白酶[3], 研究[4-5]發(fā)現(xiàn)ADAMTS18在食管癌、骨肉瘤中具有潛在的抑癌作用。本研究采用臨床數(shù)據(jù)分析及體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)等方法，探討ADAMTS18在HCC中的臨床價(jià)值及其對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年1月—2016年1月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本50例，包括男35例，女15例，年齡55～72歲，中位年齡為58歲。兔抗人SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。LO2、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97-H及Huh-7細(xì)胞均由肝膽外科實(shí)驗(yàn)室保存。ADAMTS18一抗(ab135728)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;AKT一抗(#4685)、磷酸化AKT一抗(p-AKT, #13038)、 E-cadherin一抗(#14472)及GAPDH一抗(#5174)均購(gòu)自美國(guó)CST公司。RNA提取試劑Trizol(#15596026)、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(#L3000015)及RT-PCR試劑盒(#10928042)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(#1725120)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。Transwell小室(#3458)購(gòu)自美國(guó)CORNING公司。人工基質(zhì)膠(#354230)購(gòu)自美國(guó)B&D公司。ADAMTS18引物(上游5′-ACCTTGACCAGAACACCATCGAG-3′; 下游5′-CAGGGTCCAGGTCAGGTGTGTA-3′), GAPDH引物(上游5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′; 下游5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′)由上海生工生物工程公司合成。ADAMTS18過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)組織中ADAMTS18表達(dá): 福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟、水化及微波抗原修復(fù)，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用PBS溶液按1∶100比例配制ADAMTS18一抗工作液，覆蓋組織切片, 4 ℃搖晃、孵育過夜。PBS溶液洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗, DAB法顯示陽性蛋白。計(jì)算切片染色得分[6]: 無陽性染色細(xì)胞為0分, <25%為1分, 25%～<50%為2分, 50%～<75%為3分, ≥75%為4分。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)ADAMTS18表達(dá): 使用Trizol試劑按操作指南提取LO2、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97-H及Huh-7細(xì)胞總RNA。定量后，每種細(xì)胞取等量RNA配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。cDNA稀釋10倍后，取5 μL配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng): 95 ℃預(yù)變性30 s, 1循環(huán); 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火延伸30 s, 40循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算ADAMTS18 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染: Huh-7細(xì)胞過夜培養(yǎng)達(dá)50%～70%密度后接種于6孔板中。ADAMTS18質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分組: 陰性對(duì)照組(Vec-ctrl)每孔加入4 μg的陰性對(duì)照質(zhì)粒及10 μL轉(zhuǎn)染試劑, ADAMTS18組(Vec-ADAMTS18)每孔加入4 μg的ADAMTS18質(zhì)粒及10 μL轉(zhuǎn)染試劑; 以無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積為2 mL/孔。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.4 Transwell小室模型檢測(cè)Huh-7細(xì)胞遷移和侵襲: 取轉(zhuǎn)染48 h后的Huh-7細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，以2×105/mL的密度每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入750 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將小室放于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋50 mg/L的基質(zhì)膠100 μL/孔覆蓋Transwell小室上室面，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)風(fēng)干1 h制成侵襲小室模型，重復(fù)上述細(xì)胞種植操作，建立細(xì)胞侵襲檢測(cè)模型。培養(yǎng)完成后, PBS清洗小室、4%多聚甲醛固定，并用0.1%的結(jié)晶紫染色10 min。擦除上室面未成功穿過小室膜的細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)下室面細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5 蛋白免疫印跡: 提取轉(zhuǎn)染48 h后的Huh-7細(xì)胞總蛋白并調(diào)齊所有樣品的蛋白濃度。采用垂直電泳法，利用4%～10% SDS-PAGE凝膠按分子量大小分離總蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法，按100V轉(zhuǎn)印2 h的條件將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上, 5% BSA室溫封閉NC膜1 h。裁取目的蛋白所在的位置條帶，按1∶1 000比例配制ADAMTS18、蛋白激酶B(AKT)、AKT磷酸化(p-AKT)、E-cadherin及GAPDH一抗, 4 ℃孵育過夜。PBS洗去未結(jié)合一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔(鼠)二抗室溫孵育NC膜1 h。于暗室內(nèi)，ECL法曝光目的蛋白，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，非連續(xù)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用Pearson卡方檢驗(yàn)，連續(xù)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用配對(duì)或兩獨(dú)立樣本student-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADAMTS18在HCC組織中表達(dá)及臨床意義

ADAMTS18亞細(xì)胞表達(dá)定位主要在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。對(duì)HCC及癌旁組織的ADAMTS18表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), HCC組織中的ADAMTS18的平均表達(dá)水平為(1.96±0.58), 對(duì)應(yīng)癌旁組織為(3.61±0.39), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.876,P=0.003)。以HCC組織中ADAMTS18平均表達(dá)值為截?cái)帱c(diǎn)，將50例HCC患者分為ADAMTS18高表達(dá)組(n=32)與ADAMTS18低表達(dá)組(n=18)。分析2組臨床資料發(fā)現(xiàn), ADAMTS18低表達(dá)與HCC血管侵犯(P=0.018)及TNM分期(P=0.038)密切相關(guān)。見表1。

2.2 ADAMTS18在HCC細(xì)胞中的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞LO2中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)水平相比, 4種HCC細(xì)胞中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1、2。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，作者在內(nèi)源性ADAMTS18表達(dá)量最低的Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)入ADAMTS18過表達(dá)質(zhì)粒。蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染vec-ctrl質(zhì)粒組Huh-7細(xì)胞內(nèi)ADAMTS18表達(dá)水平為(0.21±0.11), 轉(zhuǎn)染vec-ADAMTS18質(zhì)粒組為(0.86±0.24), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.551,P=0.013)。

表1 ADAMTS18異常表達(dá)在HCC中的臨床意義

HBsAg: 乙肝表面抗原。與高表達(dá)組比較, *P<0.05。

與LO2比較, ?P<0.05。圖1 不同HCC細(xì)胞中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)水平比較

圖2 免疫印跡法檢測(cè)ADAMTS18在HCC細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 過表達(dá)ADAMTS18抑制Huh-7細(xì)胞遷移及侵襲

轉(zhuǎn)染vec-ctrl質(zhì)粒組細(xì)胞遷移數(shù)量為(48.29±6.48)個(gè)，而轉(zhuǎn)染vec-ADAMTS18質(zhì)粒組細(xì)胞遷移數(shù)量為(27.45±8.02)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.536,P=0.038)。轉(zhuǎn)染Vec-ctrl質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲數(shù)量為(32.15±4.95)個(gè)，而轉(zhuǎn)染vec-ADAMTS18質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲數(shù)量為(13.86±6.03)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.684,P=0.027)。過表達(dá)ADAMTS18抑制了Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.4 過表達(dá)ADAMTS18抑制AKT的磷酸化并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)

AKT的活化狀態(tài)是影響HCC細(xì)胞遷移侵襲的重要分子機(jī)制之一。本研究顯示，轉(zhuǎn)染vec-ADAMTS18質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平為(0.12±0.05), 低于轉(zhuǎn)染vec-ctrl質(zhì)粒組細(xì)胞(0.31±0.08), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.416,P=0.047)。2組細(xì)胞AKT的總表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，過表達(dá)ADAMTS18的Huh-7細(xì)胞內(nèi)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平為(0.33±0.06), 而vec-ctrl組細(xì)胞為(0.10±0.03), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.581,P=0.032)。見圖3、4。

圖3 過表達(dá)ADAMTS18抑制AKT的磷酸化并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)

與vec-ctrl比較, ?P<0.05。圖4 轉(zhuǎn)染vec-ADAMTS18質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染vec-ctrl質(zhì)粒組p-AKT、t-AKT、E-cadherin表達(dá)

3 討 論

發(fā)育生物學(xué)研究[7]證實(shí), ADAMTS18在骨骼、視覺系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等正常組織發(fā)育過程中具有重要作用，其基因的突變、異常甲基化修飾及表達(dá)缺失均會(huì)導(dǎo)致畸形及先天性疾病的發(fā)生。本研究通過50例HCC及其對(duì)應(yīng)癌旁組織樣本的檢測(cè)結(jié)果證實(shí), ADAMTS18在HCC組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào), ADAMTS18低表達(dá)與腫瘤存在血管侵犯和較晚的TNM分期密切相關(guān)。最新研究[8]也顯示, ADAMTS18低表達(dá)的宮頸癌患者臨床分期更晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高、5年生存率更低，在胃癌[9]和結(jié)腸癌[10]中也有相似的研究結(jié)果。這提示ADAMTS18低表達(dá)是存在于多種人類惡性腫瘤中的高頻率分子事件, ADAMTS18可能是一種有潛在臨床價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。

臨床分析結(jié)果表明, ADAMTS18可能與腫瘤轉(zhuǎn)移特征關(guān)系密切，在本研究的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分，作者通過Transwell小室模型證實(shí)過表達(dá)ADAMTS18可以顯著抑制HCC細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力。研究[11]還顯示, ADAMTS18在動(dòng)物體內(nèi)還具有抑制肺轉(zhuǎn)移癌形成的能力。AKT信號(hào)通路的異?；罨荋CC細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要分子機(jī)制之一[12], 磷酸化激活的AKT能通過NF-KB、SNAIL及HIF-1等多種途徑[13-15]下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變(EMT)而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ADAMTS18能夠削弱AKT的磷酸化，同時(shí)提高Huh-7細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平，這提示ADAMTS18的抗HCC遷移侵襲功能與AKT通路和EMT現(xiàn)象有關(guān)。

綜上所述, ADAMTS18表達(dá)下調(diào)與HCC惡性臨床特征密切相關(guān)，其作為一種抑癌基因，在抗HCC細(xì)胞遷移侵襲的過程中發(fā)揮重要作用。