HPLC法測(cè)定水溶性肥料植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不確定度評(píng)定

段路路, 黃婧*, 王凱越

(1.上?；ぴ簷z測(cè)有限公司, 上海 200062; 2.上?；ぱ芯吭河邢薰? 上海 200062)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一類植物生長(zhǎng)激素，在低濃度下即具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的作用，通常由人工合成或者從生物中提取[1]。常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯和赤霉素等[2]。其中，脫落酸(abscisic acid, ABA)可影響植物性別分化、促進(jìn)花芽分化或果實(shí)成熟等；氯吡脲(forchlorfenuron，F(xiàn)LFR)對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用效果優(yōu)異；萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)具有促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)不定根形成等特點(diǎn)；烯效唑(uniconazole，S-3307)可抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)、使作物矮壯，通常作為果樹、花卉等的生長(zhǎng)延緩劑。合理使用這些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以明顯提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，并能提高經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。據(jù)有關(guān)學(xué)者統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)境內(nèi)批準(zhǔn)登記使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑品種有38個(gè)，共587個(gè)產(chǎn)品[3]。目前，我國(guó)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的年產(chǎn)量接近2 000 t，常用品種近百個(gè)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用一直受到社會(huì)的普遍關(guān)注[4]。

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，肥料對(duì)糧食增產(chǎn)增效具有不可替代的作用，因此肥料的合理使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中起到了積極的增產(chǎn)作用。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑屬于農(nóng)藥登記的范疇，很多水溶性肥料生產(chǎn)企業(yè)將脫落酸、氯吡脲、萘乙酸和烯效唑等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑添加到肥料中，給肥料產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。吳愛(ài)娟等[5]研究表明，違規(guī)或過(guò)量施的這4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，會(huì)在農(nóng)作物植株中并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，被吸收后會(huì)不斷積累，導(dǎo)致人體支端肥大、骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤等疾病，且易使兒童提前發(fā)育、過(guò)早成熟等，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致人體免疫功能下降，甚至出現(xiàn)致畸、致癌、致基因突變等嚴(yán)重后果，并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響。因此建立水溶性肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法，迫在眉睫。

目前，水果、蔬菜中氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脫落酸等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留常用酶聯(lián)免疫法、萃取-光度法、液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法[6-13]等檢測(cè)，其測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量需要用不確定度來(lái)表示。不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，用于表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，測(cè)量水平越高，試驗(yàn)質(zhì)量越高，則測(cè)量不確定度越小，反之亦然。隨著科技的發(fā)展，為了更合理、科學(xué)地控制食量，不確定度被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食藥品檢驗(yàn)等領(lǐng)域中。為了表征檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常采用不確定度[14-16]來(lái)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明，一般可以從人的因素(人)、儀器因素(機(jī))、物料因素(料)、檢測(cè)方法因素(法)和環(huán)境因素(環(huán))5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，即不確定度越小，表明測(cè)量結(jié)果越準(zhǔn)確、越可信。目前國(guó)內(nèi)外已有對(duì)肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)的報(bào)道，但對(duì)于水溶性肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)的不確定性評(píng)定，尚未見(jiàn)報(bào)道?；诟咝б合嗌V法具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，本研究擬參考化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[17]以及相關(guān)資料[18-19]，用前處理方式和HPLC條件對(duì)水溶性肥料中的氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脫落酸4種常見(jiàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行分析測(cè)定，從實(shí)驗(yàn)室采用的試驗(yàn)方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、儀器設(shè)備、樣品前處理過(guò)程等因素進(jìn)行不確定度評(píng)定[20-21]，對(duì)不確定度的來(lái)源從人、機(jī)、料、法、環(huán)方面進(jìn)行來(lái)源分析，從而建立HPLC法測(cè)定水溶性肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的不確定度數(shù)學(xué)模型，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。研究結(jié)果表明，本研究開(kāi)發(fā)出的檢測(cè)方法是一個(gè)操作簡(jiǎn)單、效率高的檢測(cè)系統(tǒng)，可為水溶性肥料行業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

共選用4個(gè)水溶性肥料產(chǎn)品，分別編號(hào)為WSF1、WSF2、WSF3、WSF4。所用的4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為氯吡脲(純度99.6%，德國(guó)Dr.Ehrensforfer公司)、1-萘乙酸(純度96.9%，德國(guó)Dr.Ehrensforfer公司)、烯效唑(純度99.8%，德國(guó)Dr.Ehrensforfer公司)、脫落酸(純度98.0%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。試驗(yàn)所用主要試劑為甲醇(色譜純)、甲酸(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20 A高效液相色譜儀(日本島津公司)，帶二極管陣列檢測(cè)器(SPD-M 20 A),柱溫箱(CTO-20 A)和PDA數(shù)據(jù)處理器；ME204-2電子天平(梅特勒公司)；漩渦混合器；超聲波清洗器；高速離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑4種標(biāo)準(zhǔn)品0.090 0～0.110 0 g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，溶液濃度為1 mg·mL-1，然后配置濃度依次為2、10、25、50、100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2樣品前處理 稱取0.100 0～1.000 0 g水溶性肥料樣品，置于10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容后高速離心10 min，取1 mL上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。

1.3.3分析條件 色譜柱選用Shim-pack C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm(氯吡脲、烯效唑、脫落酸)或280 nm(萘乙酸)，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.4數(shù)學(xué)模型的建立 用以下公式對(duì)試樣中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量建立數(shù)學(xué)模型。

式中，W指試樣中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑的含量(mg·kg-1)；c0指試樣溶液中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的實(shí)測(cè)濃度(mg·L-1)；V指樣品定容體積(mL)；m指樣品稱樣質(zhì)量(g)。

君不行仁政而富之，皆棄于孔子者也，況于為之強(qiáng)戰(zhàn)？爭(zhēng)地以戰(zhàn)，殺人盈野；爭(zhēng)城以戰(zhàn)，殺人盈城，此所謂率土地而食人肉，罪不容于死。故善戰(zhàn)者服上刑，連諸侯者次之，辟草萊、任土地者次之。[4](P283)

(1)

urel(c0)=u(c0)/c0

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

U=2uc(w)

(9)

1.4 識(shí)別與分析測(cè)定過(guò)程的不確定度來(lái)源

根據(jù)測(cè)量步驟以及上述數(shù)學(xué)模型的計(jì)算公式分析，可得HPLC法測(cè)定水溶性肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的不確定度初步因果圖(圖1)。根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[12]中的規(guī)定，使用最小二乘法擬合c0的前提是,假設(shè)橫坐標(biāo)的不確定度遠(yuǎn)小于縱坐標(biāo)的不確定度，即用于定量的工作曲線溶液濃度的不確定度足夠小，以致于可以忽略不計(jì)。

圖1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑測(cè)定的不確定度來(lái)源因果圖

2 結(jié)果與分析

2.1 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的不確定度

為校準(zhǔn)高效液相色譜儀，采用準(zhǔn)確稱量脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成2、10、25、50、100 mg·L-15種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用高效液相色譜儀測(cè)定3次，可以得到相應(yīng)的峰面積A，用最小二乘法擬合，得到每種標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的直線回歸方程A=a+b×c(a為線性方程的截距，b為線性方程的斜率)和R2(表2)。R2值均大于0.999，表明4種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度與高效液相色譜儀測(cè)定的響應(yīng)值顯著正相關(guān)，用此方法測(cè)量的精密度較高。

表2 4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最小二乘法擬合的線性關(guān)系

由濃度—峰面積最小二乘法擬合求得試樣溶液的濃度(c0)，則c0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[u(c0)]和相對(duì)不確定度[urel(c0)]參照1.3.5中公式(1)和(2)計(jì)算，因?yàn)槊糠N植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑測(cè)試3次，檢測(cè)了4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，因此式中n=3×4=12；測(cè)定次數(shù)(p)為1。4個(gè)樣品的u(c0)和urel(c0)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液最小二乘法擬合引入的不確定度

2.2 試樣稱樣引入的不確定度

表4 樣品稱量引入的不確定度

2.3 試樣溶液定容引入的不確定度

2.4 試驗(yàn)過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度

表5 測(cè)量過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度

2.5 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

根據(jù)以上研究，水溶性肥料樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量測(cè)定產(chǎn)生的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性擬合引入的不確定度、樣品稱重產(chǎn)生的不確定度以及樣品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度。因此，采用HPLC法測(cè)定水溶性肥料中4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相對(duì)合成不確定度[ucrel(w)]和合成不確定度[uc(w)]，參照1.3.5中公式(7)和(8)。

在95%置信度水平下，取擴(kuò)展因子(k)為2，則HPLC法測(cè)定植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的擴(kuò)展不確定度為：U=2×uc(w)，按照此公式計(jì)算4個(gè)樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不確定度，結(jié)果(表6)可知，相對(duì)合成不確定度的來(lái)源主要是樣品濃度測(cè)定中標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度和樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度。

表6 樣品中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不確定度

圖2 4種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑擴(kuò)展不確定度與含量的線性擬合

3 討論

不確定度是用于說(shuō)明測(cè)量分散性的參數(shù)，由分析和評(píng)定得到，科學(xué)的評(píng)估方法是關(guān)鍵。不確定度評(píng)定是提高檢測(cè)質(zhì)量要求的主要內(nèi)容，不確定度越小，表明測(cè)量結(jié)果越準(zhǔn)確可信。不確定度評(píng)定主要包括以下幾個(gè)步驟：①規(guī)定被測(cè)量不確定度；②識(shí)別不確定度的來(lái)源；③不確定度分量確定并計(jì)算；④計(jì)算合成不確定度；⑤報(bào)告不確定度。本研究建立了HPLC法測(cè)定水溶性肥料中脫落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑含量的測(cè)試系統(tǒng)，并對(duì)測(cè)定過(guò)程中不確定度來(lái)源的各個(gè)分量進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，建立的HPLC檢測(cè)方法測(cè)定水溶性肥料中不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不確定度數(shù)學(xué)模型，是一個(gè)操作簡(jiǎn)單且效率高的檢測(cè)系統(tǒng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，影響HPLC法測(cè)定水溶性肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的測(cè)量不確定度主要有兩個(gè)來(lái)源，一是定量測(cè)定中使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配置成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性擬合引入的不確定度，二是樣品測(cè)試過(guò)程中引入的隨機(jī)效應(yīng)即重復(fù)測(cè)定，而使用的不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、樣品的稱量、樣品前處理等引入的不確定度對(duì)最終的合成不確定度影響不大。郭霞等[23]用HPLC法測(cè)定了復(fù)混肥料中縮二脲含量的不確定度，得出影響結(jié)果的主要不確定度分量為擬合校準(zhǔn)曲線引入的不確定度；郝霞莉等[24]用高效液相色譜法檢測(cè)了脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的不確定度，認(rèn)為主要不確定度來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制以及試樣測(cè)量重復(fù)性；肖利龍等[25]通過(guò)HPLC法研究了花生醬中黃曲毒素B1結(jié)果的不確定度評(píng)定，認(rèn)為影響檢測(cè)結(jié)果的6個(gè)不確定度分量中，樣品前處理過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度對(duì)結(jié)果影響較大；牛日華[26]采用液相色譜法對(duì)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)溶液；李煜婷等[27]用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定了土壤中苯并(a)芘的不確定度，研究表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配置產(chǎn)生的不確定度對(duì)合成不確定度的影響較大，而樣品稱量所引入的不確定度較小，可忽略不計(jì)；劉文星[28]研究了液相色譜法測(cè)定戊醛中催化劑不確定度的評(píng)定，其中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品測(cè)量重復(fù)性對(duì)測(cè)量不確定度的影響較大?？梢?jiàn)上述研究與本研究類似，均表明用HPLC法測(cè)定食品、化工品、土壤、肥料等不同基體中的特定物質(zhì)含量的不確定度評(píng)定中，主要不確定度來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和線性擬合；此外，由于研究對(duì)象基體不同，樣品測(cè)定重復(fù)性對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)也較大。因此，建議在分析過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)首先評(píng)估實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引起不確定度的各個(gè)分量的貢獻(xiàn)，排除不重要的分量，同時(shí)熟練掌握操作步驟，提高標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的準(zhǔn)確性和可靠性，增加平行測(cè)定次數(shù)，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本研究為水溶性肥料中其它植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量測(cè)定的不確定度評(píng)定提供理論參考和依據(jù)。