吡唑醚菌酯微囊的制備及性能表征

陳慧萍 ，陳 歌 ，許春麗 ，徐 博 ，曹立冬 *，黃啟良 *

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；2.河南省藥肥緩控釋工程技術(shù)中心，河南好年景生物發(fā)展有限公司，鄭州 450000）

農(nóng)藥緩控釋制劑是提高農(nóng)藥有效利用率和減輕環(huán)境污染的理想劑型，也是農(nóng)藥新劑型發(fā)展的重要方向[1]。以環(huán)境安全性生物可降解材料為壁材的微囊化技術(shù)，已成為開發(fā)農(nóng)藥緩控釋制劑、提高農(nóng)藥利用率研究的熱點[2-3]。聚羥基丁酸酯（PHB）是一種由微生物合成的天然高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，不僅對環(huán)境無污染，在高氧條件下可被環(huán)境中的微生物降解為二氧化碳和水，在缺氧條件下則可降解為甲烷和水[4]。目前以PHB為載體對農(nóng)藥的負載和控制釋放研究已有較多報道[5]。Suave等[6]按照不同比例的PHB、聚ε-己內(nèi)酯制備的馬拉硫磷微球具有較好的成球性，且可通過調(diào)節(jié)PHB和聚ε-己內(nèi)酯的不同比例調(diào)節(jié)農(nóng)藥的釋放速率。Grillo等[7]采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備了粒徑范圍為3.47～9.67 μm的莠去津PHBV微球，與空白莠去津相比，載藥微囊在水中具有良好的緩釋性能和低的基因毒性。Cao等[8]以PHB為載體，采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備了氟樂靈微囊，微囊化可以顯著提高氟樂靈的光穩(wěn)定性和對稗草的生物活性。

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是目前普遍使用的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有保護寄主、治療病害、鏟除病原菌的作用，已廣泛應用于水稻、大豆、黃瓜等作物，防治白粉病菌、鐮刀病菌等病原真菌引起的病害。由于其對水生生物高毒，在水稻上的使用被限制[9]。吡唑醚菌酯微囊化可以降低其毒性，擴大其使用范圍。Xu等[10]將吡唑醚菌酯微囊化后，發(fā)現(xiàn)其對斑馬魚急性毒性降低，提高了對水生生物的安全性。本研究以吡唑醚菌酯為芯材，以聚羥基丁酸酯為壁材，采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備吡唑醚菌酯微囊，為吡唑醚菌酯在農(nóng)田中的減量使用和新型可控釋農(nóng)藥劑型的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

吡唑醚菌酯原藥（純度98%），江蘇安邦電化有限公司；聚羥基丁酸酯（PHB，分析純），深圳意科曼生物技術(shù)有限公司；聚乙烯醇（PVA，分析純），國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜純試劑；水稻稻瘟病菌，中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所；試驗用水為超純水。

DF-101Z型恒溫加熱電磁攪拌器，上海司樂儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TG20-WS離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；CX22光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；FD-1-50型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；RS-8G溶出度測試儀，天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司；透析袋（MWCO：8000-14000），美國光譜公司。

1.2 吡唑醚菌酯微囊的制備

采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備吡唑醚菌酯-聚羥基丁酸酯微囊。分別稱取一定量的吡唑醚菌酯原藥和PHB，用三氯甲烷溶解配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，將二者按一定比例混合為油相；稱取一定量的乳化劑PVA加至超純水中，加熱攪拌至溶解，配制成一定質(zhì)量分數(shù)的水溶液為水相；按一定油水相體積比將二者混合置于燒杯中，在設定的剪切速率下高速剪切5 min；于55℃下攪拌揮發(fā)，除去有機溶劑三氯甲烷；在設置轉(zhuǎn)速下離心10 min，用去離子水洗滌沉淀3次，冷凍干燥后得到吡唑醚菌酯微囊干粉，于干燥器中儲存。

1.3 載藥條件優(yōu)化

按照1.2制備的方法，通過改變制備參數(shù)，分別考察不同芯壁材質(zhì)量比、不同油水相體積比、不同PVA質(zhì)量分數(shù)及不同剪切速率對載藥量和包封率的影響。

1.4 性能表征

1.4.1 外觀形貌

將吡唑醚菌酯微囊超聲后制成微囊懸浮液滴于載玻片上，調(diào)節(jié)光學顯微鏡觀察微囊形態(tài)和分布，并找其特征區(qū)進行拍照；取適量微囊干粉，均勻撒布在雙面膠帶上，經(jīng)離子鍍膜儀噴金后采用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。

1.4.2 傅里葉變換紅外光譜測定

取適量固體溴化鉀（KBr）粉末分別與吡唑醚菌酯微囊、吡唑醚菌酯原藥、PHB混合均勻，壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析。

1.4.3 包封率和載藥量測定

稱取0.025 g（精確至0.000 2 g）吡唑醚菌酯微囊，用甲醇超聲溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.22 μm有機濾膜過濾，通過HPLC測定吡唑醚菌酯的質(zhì)量濃度（mg/L）。HPLC檢測條件：Extend-C18不銹鋼色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長275 nm，流動相為甲醇＋0.1%甲酸水溶液（體積比80∶20），進樣量5 μL，柱溫25℃。按式（1）和式（2）計算包封率和載藥量。

1.4.4 釋放性能測定

采用透析袋法[11]研究吡唑醚菌酯微囊在不同pH值下的釋放性能。稱取一定量的吡唑醚菌酯微囊于裝有2 mL釋放介質(zhì)的5 cm長的透析袋中，并將透析袋放入200 mL釋放介質(zhì)中（30%乙醇＋0.5%吐溫-80＋69.5%磷酸鹽緩沖溶液（pH值分別為5.00、7.16和8.94））。在30℃條件下于100 r/min轉(zhuǎn)速攪拌，每隔一段時間取透析袋外的釋放介質(zhì)1 mL，并立即補充1 mL新鮮的釋放介質(zhì)，采用1.4.3的色譜條件進行HPLC測定。按照式（3）計算累積釋放百分率并繪制累積釋放曲線[12]。

式中：Er為累積釋放百分率，%；V0為釋放介質(zhì)的總體積，mL；Cn為第n次取樣釋放液的質(zhì)量濃度，mg/L；Ve為每次取樣的體積，mL；Ci為第i次取樣時釋放液的質(zhì)量濃度，mg/L；m為吡唑醚菌酯微囊有效成分總質(zhì)量，mg。

1.4.5 室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法測定所制備吡唑醚菌酯微囊對稻瘟病菌的殺菌活性。將供試藥劑與馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基充分混勻后制成不同濃度的含藥培養(yǎng)基，每個處理設置3個重復。藥劑的質(zhì)量濃度分別為0.05、1.00、5.00和10.00 mg/L。將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化5 d，沿菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器打菌餅，用鑷子挑取菌餅反向置于含藥培養(yǎng)基的中央，放置于25孔恒溫培養(yǎng)箱中。黑暗培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落的直徑，取其平均值，按照式（4）計算供試藥劑各濃度的菌絲生長抑制率[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 載藥條件優(yōu)化

不同微囊制備參數(shù)下吡唑醚菌酯載藥量和包封率試驗結(jié)果見表1。綜合考慮載藥量和包封率，確定最優(yōu)條件為PVA質(zhì)量分數(shù)2%，芯壁材質(zhì)量比1∶5，油水體積比1∶20，剪切速率8 000 r/min，其載藥量和包封率分別為15.00%和74.40%。

表1 吡唑醚菌酯微囊載藥量和包封率測定結(jié)果

2.2 外觀形貌

分別采用光學顯微鏡和電子掃描顯微鏡對微囊的外觀和粒徑進行了表征，結(jié)果見圖1。微囊呈規(guī)則的球形，大小不均。選取掃描電鏡圖片上100個不同大小的微囊進行統(tǒng)計分析，平均粒徑為1.9 μm，與動態(tài)光散射測定的平均粒徑1.8 μm（分散度指數(shù)為0.6）基本一致。Luo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小粒徑的辛硫磷微囊具有較快的釋放速率和優(yōu)異的葉面沉積性能，具有良好的速效殺蟲活性；粒徑大的辛硫磷微囊具有持續(xù)的釋放性能，持效性較好。綜合考慮，將不同粒徑大小的微囊同時使用可達到最佳的防治效果。因此，從實際應用效果來看，本研究制備的粒徑分布較寬的吡唑醚菌酯微囊也具有良好的應用前景。掃描電子顯微鏡下觀察到的一些不規(guī)則的吡唑醚菌酯微囊顆粒，可能是由于機械攪拌或干燥過程中水分的蒸發(fā)，成膜性高分子材料聚羥基丁酸酯干燥之后殘留下來等原因造成的[10,15]。

圖1 吡唑醚菌酯微囊的形貌

2.3 紅外光譜分析

吡唑醚菌酯微囊、吡唑醚菌酯原藥和聚羥基丁酸酯的紅外光譜圖見圖2。聚羥基丁酸酯紅外光譜圖中1 740 cm-1處是O=C=O伸縮振動的位置；吡唑醚菌酯在1 550 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)特征峰（苯環(huán)骨架上C-H鍵的伸縮振動峰），而所制備的吡唑醚菌酯微囊在1 740和1 550 cm-1處均出現(xiàn)明顯的吸收峰，證明吡唑醚菌酯被成功包覆在聚羥基丁酸酯微囊中。

圖2 吡唑醚菌酯微囊、吡唑醚菌酯原藥和聚羥基丁酸酯紅外光譜圖

2.4 吡唑醚菌酯微囊緩釋性能

吡唑醚菌酯微囊在不同pH（5.00、7.16和8.94）下的累積釋放曲線見圖3，釋放具有pH敏感特征。在堿性條件下釋放最緩慢，中性條件次之，酸性條件下釋放最快。壁材聚羥基丁酸酯在不同的pH環(huán)境下降解速率不同導致釋放速率差異。在酸性條件下，由于產(chǎn)酸菌的存在，壁材降解加速[16]，從而導致微囊破裂，吡唑醚菌酯釋放加快。

圖3 吡唑醚菌酯微囊在不同pH下的累積釋放曲線

2.5 吡唑醚菌酯室內(nèi)生物活性測定

采用菌絲生長速率法測定原藥和微囊制劑的生物活性。吡唑醚菌酯原藥和微囊對水稻稻瘟病病原菌的生物活性結(jié)果見圖4、圖5。隨著濃度的增加，原藥和微囊的抑制率均逐漸增加，在第7 d時，10.00 mg/L吡唑醚菌酯原藥和微囊的抑制率分別為74.63%和62.32%。原藥對水稻稻瘟病菌的抑制效果比微囊好，但二者差異不顯著，微囊因緩釋性能可以延長其持效期，提高利用率，降低對環(huán)境的風險。

圖4 第7 d時吡唑醚菌酯原藥與微囊不同濃度下對稻瘟病病原菌的抑制率

圖5 第7 d時水稻稻瘟病病原菌菌絲在不同濃度藥劑下的生長情況

3 結(jié) 論

本研究以吡唑醚菌酯為模式藥物，以聚羥基丁酸酯為壁材，采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備了吡唑醚菌酯微囊，其外觀呈現(xiàn)規(guī)則的球形，平均粒徑1.9 μm。通過微囊制備工藝優(yōu)化，篩選出了較為適宜的配比與制備條件：PVA質(zhì)量分數(shù)2%，芯壁材質(zhì)量比1∶5，油水體積比1∶20，剪切速率8 000 r/min，其載藥量為15.00%，包封率為74.40%。吡唑醚菌酯微囊具有良好的pH敏感性和緩釋性能。室內(nèi)生物活性測定結(jié)果表明，吡唑醚菌酯微囊對水稻稻瘟病病原菌具有良好的防治效果。本研究所用的聚羥基丁酸酯具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，是一種環(huán)境友好型材料，可廣泛應用于農(nóng)藥的負載。同時可通過制備工藝優(yōu)化，調(diào)控農(nóng)藥的釋放速率，延長農(nóng)藥的持效期，減少農(nóng)藥的用量，延緩病害的抗藥性，可為緩控釋農(nóng)藥新劑型的研發(fā)提供新的思路和技術(shù)支撐。