多形漢遜酵母提高生長(zhǎng)性能的培養(yǎng)基優(yōu)化

劉 爽，高教琪，薛 闖，周雍進(jìn)

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116031；2.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116024)

多形漢遜酵母(Ogataeapolymorpha)是目前一種應(yīng)用較為廣泛的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母[1]，其生長(zhǎng)繁殖速度快[2]、底物利用廣泛、耐受溫度高[3]、易于發(fā)酵培養(yǎng)，適于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)高附加值化學(xué)品[4]。早在1995年時(shí)，Weydemann等[5]在漢遜酵母菌株中表達(dá)水蛭素變異體HV1亞型，成功構(gòu)建了水蛭素生產(chǎn)菌株O.polymorphaRB11，產(chǎn)量達(dá)1 g/L。目前，漢遜酵母作為宿主細(xì)胞主要應(yīng)用于低級(jí)醇[6-7]、天然產(chǎn)物[5,8-9]以及蛋白質(zhì)[10-11]的發(fā)酵生產(chǎn)。同時(shí)，漢遜酵母近年來越來越受到人們的關(guān)注，主要是因其具有優(yōu)良的甲醇代謝能力[12]。

甲醇作為最簡(jiǎn)單的化學(xué)品之一，是十分重要的C1有機(jī)化工原料和化工基礎(chǔ)產(chǎn)品[13]。甲醇最初來源于木材干餾[14]，但現(xiàn)在的工藝已經(jīng)可以利用煤炭經(jīng)過氣化或天然氣經(jīng)過蒸汽重整大規(guī)模合成，這就可避免與人爭(zhēng)糧、與動(dòng)物爭(zhēng)糧的問題[15]。甲醇作為具有清潔特性的重要液體燃料，具有便于攜帶和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。因此被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)合成、染料、涂料和汽車等行業(yè)中[16]。同時(shí)，甲醇作為微生物發(fā)酵底物，可合成具有高附加值的產(chǎn)品，日益成為合成生物學(xué)和代謝工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[17]。

但目前多形漢遜酵母發(fā)酵培養(yǎng)基大多使用蛋白胨和酵母粉，這就使發(fā)酵成本一直高居不下，降低發(fā)酵培養(yǎng)基成本是實(shí)現(xiàn)多形漢遜酵母大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要前提。維生素，是維持生物機(jī)體生命活動(dòng)所必需的一類有機(jī)化合物，同時(shí)也是保持機(jī)體健康生長(zhǎng)必要的活性物質(zhì)[18]。氨基酸是維持生物機(jī)體生命活動(dòng)所必需的基本物質(zhì)，是合成各種蛋白質(zhì)的必要成分，參與機(jī)體肌肉、皮膚、臟器、酶和免疫抗體等物質(zhì)的合成[19]。維生素和氨基酸雖然含量極少，卻在生長(zhǎng)、新陳代謝以及發(fā)育等過程中發(fā)揮著不可替代的作用[20]。因此，如果利用維生素和氨基酸來代替蛋白胨和酵母粉等昂貴且復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成分，在保證良好細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，將能夠極大地降低培養(yǎng)基成本。

本文中，筆者從基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基出發(fā)，優(yōu)化葡萄糖和甲醇2種培養(yǎng)基中維生素和氨基酸的種類和濃度。同時(shí)，利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)法，確定維生素和氨基酸成分的最少添加量，以期得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基來促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，簡(jiǎn)化培養(yǎng)基組成，降低發(fā)酵成本，對(duì)大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

OgataeapolymorphaNCYC495菌株保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號(hào)CGMCC 2.2412。

1.2 試劑與儀器

丙酮酸脫氫酶可見分光光度法試劑盒、丙酮酸羧化酶微量法試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司；甲醇、葡萄糖、瓊脂粉、無(wú)水KH2PO4、各種氨基酸試劑以及各種維生素試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；(NH4)2SO4、MgSO4以及trace metal溶液中的各種試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉等，OXOID公司。其中trace metal溶液配方(pH 4.0,g/L)：FeSO4·7H2O 3.0、ZnSO4·7H2O 4.5、CaCl·2H2O 4.5、MnCl2·4H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.3、CuSO4·5H2O 0.3、H3BO31.0、Na2MoO4·2H2O 0.4、KI 0.1、Na2EDTA·2H2O 19.0。

Macy UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，美析(中國(guó))儀器有限公司；ZQZY-CF8型三層組合全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Heraeus Multifuge X1R型離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；HPX-9052 MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

從平板中挑取單菌落至5 mL 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基中(15 mL離心管)，搖床活化24 h左右后，吸取200 μL菌液轉(zhuǎn)接至20 mL YPD培養(yǎng)基中(100 mL錐形瓶)搖床培養(yǎng)16～18 h為種子液。取適量種子液于15 mL離心管內(nèi)，1 000g、5 min離心，去上清，使用與種子液體積相同的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基洗2次后，使初始OD600為0.1時(shí)接入相應(yīng)培養(yǎng)基中，發(fā)酵體積為50 mL(250 mL錐形瓶)，每組3個(gè)平行。本研究中培養(yǎng)溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

1.3.2 培養(yǎng)基中維生素成分的優(yōu)化

以分別添加單獨(dú)的7種維生素成分的7個(gè)培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，以添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照組，以不添加任何維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。隨時(shí)間測(cè)定600 nm處的OD600作為生物量指標(biāo)，判斷培養(yǎng)基的優(yōu)劣。

1.3.3 培養(yǎng)基中氨基酸成分的優(yōu)化

以分別添加單獨(dú)的10種氨基酸成分的10個(gè)培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，以添加混合氨基酸溶液的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照組，以不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。隨時(shí)間測(cè)定600 nm處的OD600，判斷培養(yǎng)基的優(yōu)劣。

1.3.4 丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的酶活性測(cè)定

測(cè)定丙酮酸脫氫酶活性的原理：丙酮酸脫氫酶催化丙酮酸脫氫，同時(shí)將作為電子受體的2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP)還原，從而導(dǎo)致605 nm處光吸收A605的減少。

測(cè)定丙酮酸羧化酶活性的的原理：丙酮酸羧化酶催化丙酮酸、CO2和水在ATP的作用下生成草酰乙酸，并且將ATP分解成ADP和Pi，之后蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH發(fā)生反應(yīng)，生成蘋果酸和NAD+，產(chǎn)生的NAD+與特異的顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生在450 nm處最大吸收峰的黃色物質(zhì)，通過檢測(cè)該黃色物質(zhì)在450 nm處的增加速率，即可反映丙酮酸羧化酶的活性。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)法優(yōu)化添加濃度

Box-Behnken試驗(yàn)法具有可以方便有效地測(cè)試多個(gè)過程變量并且可以識(shí)別和量化多個(gè)變量之間復(fù)雜的交互作用的特點(diǎn)[21]。因此研究中使用此方法對(duì)同時(shí)添加的多種維生素或氨基酸之間相互作用時(shí)的最優(yōu)濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基

2.1.1 優(yōu)化添加的維生素的種類和濃度

首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加混合維生素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，以不添加任何其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，以分別單獨(dú)添加7種維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

首先測(cè)定發(fā)酵至平臺(tái)期時(shí)各個(gè)培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見圖1(a)、(b)。由圖1(a)、(b)可知：分別單獨(dú)添加的7種維生素中對(duì)多形漢遜酵母在此培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用最明顯的是生物素成分；不添加任何維生素成分的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中菌種生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵至80 h的OD600只能達(dá)到2.0，而添加了混合維生素溶液的培養(yǎng)基中的菌種發(fā)酵至平臺(tái)期OD600可達(dá)到13.6，是空白對(duì)照組的近7倍；在分別單獨(dú)添加各種維生素溶液的7個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)生長(zhǎng)促進(jìn)效果最明顯的是生物素成分，發(fā)酵的最大OD600同樣可以達(dá)到13.6，與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基相當(dāng)。由此可見，只需單一生物素成分即可以明顯促進(jìn)多形漢遜酵母在葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。

其次，對(duì)單獨(dú)添加的生物素濃度進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)混合維生素溶液中生物素的濃度，選取0.005、0.025、0.050和0.100 mg/L這4個(gè)質(zhì)量濃度的生物素進(jìn)行單獨(dú)添加，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1(c)。由圖1(c)可知，4組生長(zhǎng)曲線均在27 h左右達(dá)到了發(fā)酵平臺(tái)期，最大OD600都在11～12。由此可見，添加不同濃度的生物素溶液對(duì)葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中多形漢遜酵母菌種生長(zhǎng)的促進(jìn)作用幾乎沒有差異。因此，為了降低培養(yǎng)基的成本，只需選取最少量添加，即培養(yǎng)基中添加的生物素質(zhì)量濃度為0.005 mg/L。

2.1.2 優(yōu)化添加氨基酸種類和濃度

為了確定氨基酸混合溶液中10種不同氨基酸促進(jìn)作用，分別在葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加10種氨基酸成分，同時(shí)以添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組，以不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，測(cè)定發(fā)酵至平臺(tái)期(115 h)時(shí)各個(gè)培養(yǎng)基的OD600，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸是對(duì)多形漢遜酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用的最主要的3種成分。發(fā)酵時(shí)間至115 h，不添加任何氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中多形漢遜酵母菌株的OD600達(dá)到3左右，而添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基的OD600能達(dá)到10。分別單獨(dú)添加天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸這3種成分的培養(yǎng)基，發(fā)酵至115 h的OD600分別能達(dá)到7.6、7.4和5.5。雖然這3種氨基酸單獨(dú)添加對(duì)菌種的生長(zhǎng)都有一定程度的促進(jìn)作用，但是并不及混合氨基酸溶液的促進(jìn)作用，因此決定以這3種成分的混合溶液進(jìn)行添加，以提高多形漢遜酵母在以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的OD600。

G—Delft+葡萄糖;G+Vit—Delft+葡萄糖+維生素混合溶液;G+生物素—Delft+葡萄糖+生物素圖1 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的維生素的種類和濃度Fig.1 Optimizing the types and concentrations of vitamins added to glucose medium

G+aa— Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液;G+Asp—Delft+葡萄糖+天冬氨酸;G+Glu—Delft+葡萄糖+谷氨酸;G+Met—Delft+葡萄糖+甲硫氨酸圖2 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的氨基酸種類Fig.2 Optimizing the types of amino acids added to the glucose medium

進(jìn)一步分別對(duì)天冬氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸這3種氨基酸的添加量進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)混合氨基酸溶液中的各成分濃度，甲硫氨酸選取5、10、20和40 mg/L這4個(gè)質(zhì)量濃度；天冬氨酸和谷氨酸均選取10、50、100和200 mg/L這4個(gè)質(zhì)量濃度，對(duì)分別添加上述濃度氨基酸的培養(yǎng)基的發(fā)酵過程測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖3。

G+Optimized-aa—Delft+葡萄糖+優(yōu)化的氨基酸溶液圖3 優(yōu)化葡萄糖培養(yǎng)基中添加的氨基酸濃度Fig.3 Optimization of amino acid concentrations in glucose medium

由圖3可知：甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的最佳添加量分別是40、200和200 mg/L，發(fā)酵100 h后最大OD600分別達(dá)到5.2、7.2和9.4。這些結(jié)果表明谷氨酸對(duì)多形漢遜酵母在葡萄糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的促進(jìn)最明顯。將三者結(jié)合添加后，前期生長(zhǎng)更快，菌種的生長(zhǎng)曲線幾乎與添加氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基一致，發(fā)酵至平臺(tái)期時(shí)，最大OD600能達(dá)9.3(圖3(d))。

2.1.3 培養(yǎng)基綜合優(yōu)化

上述系列試驗(yàn)確定了向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加的維生素成分：0.005 mg/L的生物素，添加的氨基酸成分為40 mg/L的甲硫氨酸、200 mg/L的谷氨酸和200 mg/L的天冬氨酸。因此嘗試將優(yōu)化的生物素和氨基酸混合加入葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，測(cè)定其OD600，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，不添加任何維生素和氨基酸成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)發(fā)酵至70 h的OD600為3，這與之前結(jié)果一致。添加混合維生素溶液和11種氨基酸混合溶液的培養(yǎng)基發(fā)酵至平臺(tái)期菌種的最大OD600達(dá)到20，是空白對(duì)照組7倍。而添加優(yōu)化后的生物素和3種氨基酸的培養(yǎng)基菌種的最大OD600也達(dá)到了20，并且優(yōu)化后的培養(yǎng)基中多形漢遜酵母的生長(zhǎng)曲線幾乎與添加全部混合溶液的培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)曲線重合。該結(jié)果表明：優(yōu)化的葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)多形漢遜酵母的生長(zhǎng)促進(jìn)與添加全部混合溶液的培養(yǎng)基一致，這樣能大大簡(jiǎn)化培養(yǎng)基中所需要添加的成分，降低了培養(yǎng)基成本。因此，最終確定向以葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加的成分：生物素0.005 mg/L、甲硫氨酸40 mg/L、谷氨酸200 mg/L、天冬氨酸200 mg/L。

G+aa+Vit—Delft+葡萄糖+氨基酸混合溶液+維生素混合溶液;G+Optimized—Delft+葡萄糖+優(yōu)化后的氨基酸和維生素溶液圖4 驗(yàn)證優(yōu)化后的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基Fig.4 Verification of optimized glucose base salt medium

2.2 優(yōu)化以甲醇為碳源的培養(yǎng)基

2.2.1 優(yōu)化添加的維生素種類

進(jìn)一步對(duì)以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中維生素和氨基酸有效成分的優(yōu)化。同樣，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探索甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分，添加混合的維生素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，以不添加任何其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，以分別單獨(dú)添加7種維生素成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，測(cè)定發(fā)酵至平臺(tái)期(培養(yǎng)90 h)時(shí)各個(gè)培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的OD600，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，生物素、泛酸鈣和維生素B1是對(duì)多形漢遜酵母在甲醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用最明顯的3種成分(圖5(a))。不添加任何維生素成分的空白對(duì)照組發(fā)酵至90 h平臺(tái)期時(shí)的OD600只能達(dá)到4，而添加了泛酸鈣、生物素和維生素B1的這3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的OD600至平臺(tái)期分別達(dá)到5、6.6和6.7(圖5(b))。雖然這3種維生素成分對(duì)菌種的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，但是分別單獨(dú)添加對(duì)菌種生長(zhǎng)的促進(jìn)作用還是不及添加混合維生素溶液的效果顯著。因此有必要研究這3種營(yíng)養(yǎng)成分的混合添加比例。

M—Delft+甲醇;M+Vit—Delft+甲醇+維生素混合溶液;M+生物素—Delft+甲醇+生物素;M+泛酸鈣—Delft+甲醇+泛酸鈣;M+VB1—Delft+甲醇+維生素B1圖5 優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類Fig.5 Optimizing the types of vitamins added to methanol medium

2.2.2 優(yōu)化添加的維生素成分種類

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)法對(duì)添加的生物素、泛酸鈣和維生素B1這3種維生素成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化。使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，甲醇培養(yǎng)基添加3種維生素的響應(yīng)面相應(yīng)立體分析圖如圖6(a)～(c)所示。最終經(jīng)過軟件模擬優(yōu)化后得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：生物素 0.005 mg/L；泛酸鈣2.00 mg/L；維生素B1為1.04 mg/L，預(yù)計(jì)最終能達(dá)到的最大OD600為10.13。

對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以添加優(yōu)化濃度后3種維生素溶液的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，以添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定3種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖6(d)所示。

由圖6(d)可知，不添加其他成分的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的最大OD600仍然在4左右。而優(yōu)化后的培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線幾乎與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基一致，發(fā)酵至平臺(tái)期時(shí)最大OD600為9.27。因此可以推定此響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果是有效的。

2.2.3 進(jìn)一步減少甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類

為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化甲醇培養(yǎng)基，嘗試將生物素、泛酸鈣和維生素B1這3種維生素成分適當(dāng)減少，考察其對(duì)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知：?jiǎn)为?dú)添加一種維生素溶液時(shí)，多形漢遜酵母在其培養(yǎng)基中的OD600沒有得到明顯提高；單獨(dú)添加維生素B1的促進(jìn)作用是最顯著的但遠(yuǎn)不及添加3種維生素溶液的促進(jìn)效果；添加生物素和維生素B1兩種維生素溶液時(shí)，發(fā)酵至平臺(tái)期的OD600為9.3，這與添加生物素、泛酸鈣和維生素B1這三種維生素溶液時(shí)的OD600(9.6)十分接近，表明減少泛酸鈣對(duì)OD600沒有影響。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，僅添加生物素(0.005 mg/L)和維生素B1 (1.04 mg/L)能顯著提高多形漢遜酵母在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，且與添加混合維生素溶液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況相當(dāng)。因此，以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，僅僅添加生物素和維生素B1即可。

2.3 優(yōu)化后的培養(yǎng)基結(jié)果及成本核算

經(jīng)過上述一系列的研究，最終分別確定了以葡萄糖和甲醇為碳源的2種培養(yǎng)基，以工業(yè)級(jí)產(chǎn)品的每噸單價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行簡(jiǎn)單的成本核算，并且與添加混合溶液的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基所需成本進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表1和2。

添加優(yōu)化后的3種維生素的質(zhì)量濃度分別為(mg/L)：生物素0.005、泛酸鈣2.00、維生素B1 1.04；M+Optimized—Delft+甲醇+優(yōu)化的維生素圖6 利用響應(yīng)面法優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的3種維生素的濃度Fig.6 Optimization of three vitamins addition to methanol medium by response surface method

1—生物素；2—泛酸鈣；3—維生素B1圖7 進(jìn)一步優(yōu)化甲醇培養(yǎng)基中添加的維生素種類Fig.7 Further optimization of vitamin types added to methanol medium

由表1和2可知，優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基每噸的成本比添加混合維生素和混合氨基酸溶液培養(yǎng)基的成本少93.14元；優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基每噸的成本比添加混合維生素溶液培養(yǎng)基的成本少4.22元，這為以后的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用降低成本。

2.4 優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞關(guān)鍵酶活力的促進(jìn)作用

綜上所述，在對(duì)多形漢遜酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化過

表1 葡萄糖培養(yǎng)基成本核算

注：各種培養(yǎng)基成分價(jià)格來源于網(wǎng)絡(luò)調(diào)研(https://www.hc360.com/)。

表2 甲醇培養(yǎng)基成本核算

注：各種培養(yǎng)基成分價(jià)格來源于網(wǎng)絡(luò)調(diào)研(https://www.hc360.com/)。

程中，筆者發(fā)現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)起到明顯促進(jìn)作用的成分是某些氨基酸(Asp、Glu和Met)和維生素成分(生物素和維生素B1)。對(duì)這種促進(jìn)作用的機(jī)制進(jìn)行推測(cè)：可能是細(xì)胞內(nèi)某些關(guān)鍵酶的酶活發(fā)生了顯著變化，從而加快了細(xì)胞對(duì)糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，進(jìn)而加快細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，為了證明上述推測(cè)，選取受這些營(yíng)養(yǎng)成分調(diào)控的關(guān)鍵酶：丙酮酸羧化酶(PC)和丙酮酸脫氫酶(PDH)，對(duì)其不同細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期的酶活性進(jìn)行測(cè)定，以證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的加快與關(guān)鍵酶活性的提高存在正相關(guān)。

2.4.1 優(yōu)化后葡萄糖培養(yǎng)基中丙酮酸羧化酶活性

丙酮酸羧化酶廣泛存在于酵母的線粒體中，與生物機(jī)體內(nèi)補(bǔ)充供給草酰乙酸的反應(yīng)緊密相關(guān)，是糖異生途徑中第一個(gè)限速酶，與維持生命機(jī)體的血糖動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。因此，丙酮酸羧化酶的活性可能加快了細(xì)胞的代謝生長(zhǎng)，進(jìn)而提高了菌體的生物量。3種氨基酸能對(duì)多形漢遜酵母的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用的原因，是它們均進(jìn)入了細(xì)胞的中心代謝，加快了細(xì)胞的代謝過程。同時(shí)推測(cè)生物素起到作用是因?yàn)樗鳛楸狒然傅妮o酶，提高了多形漢遜酵母細(xì)胞中丙酮酸羧化酶的活性。

對(duì)優(yōu)化后葡萄糖培養(yǎng)基中漢遜酵母對(duì)數(shù)中期和平臺(tái)期細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖8。由圖8可知：在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)，不添加任何維生素成分的葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為19 U/mg，添加混合維生素和混合氨基酸溶液的葡萄糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞丙酮酸羧化酶的比酶活最高，能夠達(dá)到195 U/mg，是葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的10倍，而優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為37 U/mg，是葡萄糖基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的約2倍。

2.4.2 優(yōu)化后甲醇培養(yǎng)基中丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶活性

在以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，對(duì)多形漢遜酵母在其中的生長(zhǎng)起到最明顯促進(jìn)作用的是生物素和維生素B1兩種維生素成分。一方面生物素作為丙酮酸羧化酶的輔酶，與優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基相似，其活力的提高可能極大地促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)過程。另一方面，維生素B1的輔酶形式硫胺素焦磷酸(TPP)，是丙酮酸脫氫酶的輔酶。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化丙酮酸氧化脫羧過程中重要的限速酶。PDH催化丙酮酸脫羧生成羥乙基-TPP，進(jìn)而合成乙酰輔酶A，將糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)途徑連接起來。因此，在甲醇培養(yǎng)基中添加維生素B1成分可提高細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞中TCA循環(huán)的進(jìn)行，進(jìn)一步提高了菌體的生物量。

為了驗(yàn)證上面的推測(cè)，同樣對(duì)在以甲醇為碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的多形漢遜酵母對(duì)數(shù)中期和平臺(tái)期細(xì)胞中的丙酮酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖8。

由圖8可知：在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)，不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸脫氫酶的比酶活為102 U/mg (以1 mg蛋白計(jì))，添加混合維生素溶液的甲醇培養(yǎng)基中的細(xì)胞丙酮酸脫氫酶的比酶活達(dá)到130 U/mg，而優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸脫氫酶的比酶活最高，能達(dá)到450 U/mg，超過甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的4倍。這些結(jié)果表明維生素B1的添加顯著提高了丙酮酸脫氫酶活性，從而促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)。

*表示差異顯著(0.01

在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)，不添加任何維生素成分的甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活為9 U/mg，添加混合維生素溶液的細(xì)胞丙酮酸羧化酶的比酶活達(dá)到26 U/mg，而優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基中細(xì)胞的丙酮酸羧化酶的比酶活達(dá)到82 U/mg，是甲醇基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的9.1倍。這些結(jié)果表明生物素的添加確實(shí)提高了丙酮酸羧化酶活性。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分別確定了以甲醇和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基的最終成分。在促進(jìn)多形漢遜酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，降低了發(fā)酵培養(yǎng)基組分及成本，為后續(xù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

當(dāng)以甲醇為碳源時(shí)，培養(yǎng)基組成為(NH4)2SO42.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L(營(yíng)養(yǎng)缺陷型添加)、甲醇10 g/L、生物素0.005 mg/L、維生素B1 1.04 mg/L，優(yōu)化后每噸培養(yǎng)基能節(jié)省4.22元。與未添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，OD600提高了2.5倍。優(yōu)化后的甲醇培養(yǎng)基細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶酶比酶活提高3倍以上，丙酮酸羧化酶比酶活也提高了8倍左右。

當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，培養(yǎng)基組成為(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、trace-metal 2 mL/L、亮氨酸60 mg/L、葡萄糖 20 g/L、生物素 0.005 mg/L、甲硫氨酸 40 mg/L、谷氨酸 200 mg/L、天冬氨酸 200 mg/L，優(yōu)化后每噸培養(yǎng)基節(jié)省成本93.14元。與未添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，細(xì)胞生長(zhǎng)提高了7倍以上。優(yōu)化后的葡萄糖培養(yǎng)基細(xì)胞中丙酮酸羧化酶比酶活提高了1倍。