甲羥戊酸途徑的代謝支路調(diào)控策略的研究進(jìn)展

徐鎮(zhèn)祥,李美潔,門 瀟,陳國強(qiáng),王紀(jì)明,咸 漠,張海波

(1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所生物基材料重點實驗室，山東青島266101；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250300；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合固碳產(chǎn)能中心，山東青島266109)

種類繁多的萜類化合物是廣泛存在于自然界的一大類以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元的聚合體及其衍生物。萜類化合物根據(jù)異戊二烯結(jié)構(gòu)單元(C5H8)的數(shù)目可分為半萜(C5)、單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、二倍半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)和多萜(>C40)[1]。目前發(fā)現(xiàn)的萜類化合物超過5萬多種，常見的有單萜(薄荷醇、松油醇和芳樟醇)，倍半萜(青蒿素、法尼烯和紅沒藥烯)，二萜(紫杉醇、維生素A)，三萜(人參皂苷、靈芝酸)，四萜(類胡蘿卜素化合物)等[2]。萜類化合物在制藥、香料、食品添加劑、著色劑、橡膠和高級生物燃料等行業(yè)中有著重要的應(yīng)用。目前，萜類化合物主要從植物中提取或通過化學(xué)法合成。植物提取過程易受雜質(zhì)干擾、純化分離困難，而且部分植物對生長環(huán)境要求嚴(yán)格、生長緩慢，導(dǎo)致此方法產(chǎn)量低、成本高、不可持續(xù)[3]。化學(xué)合成法則面臨著缺乏高效合成途徑、原料不可再生以及環(huán)境污染等問題[4-5]。因此，尋找新型、高效、可持續(xù)的萜類化合物合成方法尤為重要。

近年來，隨著代謝工程與合成生物學(xué)的發(fā)展，以可再生糖為原料，利用高效的微生物代謝工程合成萜類物質(zhì)是當(dāng)前生物化工領(lǐng)域的研究重點[6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的萜類化合物的生物合成途徑有兩種：甲羥戊酸途徑(MVA)和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑(MEP)[7-9]，前者主要存在于動植物中，后者主要存在于古生菌與原核生物中[10]。目前以微生物作為底盤細(xì)胞，利用底盤自身或外源的MEP或者M(jìn)VA途徑，合成目標(biāo)萜類化合物是研究的熱點。其中，MVA途徑由于具有高效性、較好調(diào)控性和輔因子需求低等優(yōu)點，是目前利用代謝調(diào)控方法提升效率的研究重點，當(dāng)前研究主要集中在對其主路徑的代謝調(diào)控策略上，而支路徑，具體包括前體物質(zhì)和輔助因子的供應(yīng)、競爭途徑的干擾等，對于提升萜類化合物的合成效率也是至關(guān)重要的。

本文中，筆者首先對甲羥戊酸(MVA)途徑進(jìn)行簡單介紹，然后從前體供應(yīng)的加強(qiáng)和輔助因子的協(xié)調(diào)、競爭途徑的調(diào)控以及間接對代謝調(diào)控產(chǎn)生影響的生物宿主的進(jìn)化三個方面，綜述萜類化合物甲羥戊酸途徑的代謝途徑支路調(diào)控策略研究進(jìn)展并進(jìn)行了部分總結(jié)(表1)，最后展望其進(jìn)一步精確調(diào)控的發(fā)展方向。

1 MVA途徑的簡介

MVA途徑可分為上游途徑與下游途徑(圖1)，該途徑通過7步催化反應(yīng)將前體物質(zhì)乙酰輔酶A(Ac-CoA)轉(zhuǎn)化為萜類化合物共同的前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)。在上游途徑中，Ac-CoA在乙酰輔酶A硫解酶(AACT)和β-羥基-β甲基戊二酰-CoA合成酶(HMGS)的催化作用下生成HMG-CoA。然后，在下游途徑中，甲羥戊酸在甲羥戊酸激酶(MK)的催化作用下生成5-磷酸-甲羥戊酸(5-MVAP)，并消耗1個ATP；5-磷酸-甲羥戊酸在甲羥戊酸磷酸激酶(PMK)作用下生成甲羥戊酸-5-二磷酸(MVAPP)，消耗1個ATP；甲羥戊酸-5-二磷酸在甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDD)的催化作用下生成異戊烯基焦磷酸(IPP)，消耗1個ATP；在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)作用下，DMAPP和IPP可以相互轉(zhuǎn)化。在糖酵解途徑中，從1分子葡萄糖合成2分子前體物質(zhì)乙酰輔酶A產(chǎn)生2分子ATP和4分子NADH，而1分子NADH在酶的催化作用下合成1分子NAD(P)H。綜上，以葡萄糖作為碳源，通過MVA途徑合成1分子IPP/DMAPP時，需要消耗1.5分子葡萄糖，產(chǎn)生4分子NAD(P)H；乙酰輔酶A是甲羥戊酸途徑最主要的前體；ATP和NAD(P)H是MVA途徑代謝過程中主要涉及到的輔因子。因此，利用代謝工程策略保證前體物質(zhì)乙酰輔酶A的供應(yīng)和協(xié)調(diào)輔因子的是提高M(jìn)VA途徑代謝流，從而進(jìn)一步提高萜類化合物產(chǎn)量的前提條件。

2 前體供應(yīng)的加強(qiáng)與輔因子的協(xié)調(diào)

MVA途徑的前體乙酰輔酶A是其上游過程中細(xì)胞中心碳代謝的關(guān)鍵因子，參與多種代謝過程，并在合成和分解代謝中發(fā)揮重要作用。因此，在不影響細(xì)胞生長的前提下加強(qiáng)上游途徑中流向MVA途徑的乙酰輔酶A是一種提升MVA途徑效率的代謝工程策略。乙酰輔酶A通過糖酵解途徑合成(圖2)。常用的提高乙酰輔酶A合成的代謝策略包括提高乙酰輔酶A合成效率和減弱或者抑制消耗乙酰輔酶A的支路途徑兩種。

表1 三種調(diào)控策略對萜類化合物產(chǎn)量的影響

注：—文獻(xiàn)中未說明。

AcAc-CoA—acetoacetyl-CoA;IP—isopentenyl phosphate;ACCT—acetoacetyl-CoA;HMGR—HMG-CoA reductase;MPD—MVAP decarboxylase;IPK—IP kinaes圖1 萜類物質(zhì)的MVA途徑和MVA途徑轉(zhuǎn)化為IPP/DMAPP的化學(xué)計量Fig.1 MVA pathway of terpenoids biosynthesis and stoichiometries of the conversion of glucose to IPP/DMAPP through the central carbon pathway and the MVA pathway

圖2 前體物質(zhì)的加強(qiáng)Fig.2 Enhancement of precursor support

過表達(dá)關(guān)鍵酶基因是提高乙酰輔酶A合成效率的常見策略。直接過表達(dá)乙酰輔酶A合成酶可顯著減少副產(chǎn)物醋酸酯的產(chǎn)生，同時減少碳的消耗，使碳通量流向MVA途徑是常用提高乙酰輔酶A合成酶(ACS)合成效率的方法[27]。過表達(dá)上游關(guān)鍵酶泛酸激酶(PANK)和丙酮酸脫氫酶(PDH)，也可提高細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平[28-29]。另外，外源引入新的乙酰輔酶A合成途徑也是提高乙酰輔酶A合成效率的一種策略。在釀酒酵母中，通過過表達(dá)木酮糖-5-磷酸特異性磷脂酶(xPK)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)和乙醛脫氫酶(ADA)這3個外源酶，以新的路徑合成乙酰輔酶A，這個新型路徑減弱了碳的流失和ATP的需求，提高了乙酰輔酶A的合成效率[30]。

通過敲除支路途徑基因或者過表達(dá)反向基因，從而抑制乙酰輔酶A的流失也是一種優(yōu)化策略。在酵母中，Chen等[14]為了盡量減少流向三羧酸循環(huán)(TCA)的乙酰輔酶A，分別敲除三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶基因CIT2和MLS1，確保形成可以運輸?shù)骄€粒體中進(jìn)行氧化的C4有機(jī)酸。Kim等[11]在改造大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯時，為了減少乙酰輔酶A副產(chǎn)物的生成，通過敲除9個相關(guān)基因形成大腸桿菌AceCo(大腸桿菌MG1655ΔackA-pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps和atoDA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AceCo菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中副產(chǎn)物積累減少，異戊二烯產(chǎn)量明顯增加，其產(chǎn)量由956 mg/L增至1 832 mg/L。乙醇和乙酸鹽是常見的乙酰輔酶A產(chǎn)物，除了通過敲除基因抑制其生成，還可以通過過表達(dá)反向合成酶挽救其代謝流。其中，ADH2的過表達(dá)使碳通量流向從乙醇轉(zhuǎn)向乙酰輔酶A，而ALD6和aceSEL641P的過表達(dá)使乙酸鹽流向乙酰輔酶A，其檀香烯產(chǎn)量由2.08 mg/L提高到8.29 mg/L，最終產(chǎn)量提高近4倍[14]。

綜上所述，通過提高合成和減弱消耗的策略加強(qiáng)前體乙酰輔酶A的供應(yīng)，從而加強(qiáng)MVA途徑代謝流，最終可以提高萜類化合物的合成。通過對宿主細(xì)胞正常生長代謝的發(fā)酵條件等因素進(jìn)行分析，僅靠提高乙酰輔酶A的濃度并不一定能夠達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的，如何更好地平衡乙酰輔酶A在細(xì)胞的合成代謝和MVA途徑的關(guān)系，保證細(xì)胞生長的同時將足夠的通量引入萜類化合物合成代謝途徑是以后研究的重要方向。

調(diào)控輔因子NAD(P)H的濃度也是利用支路代謝調(diào)控甲羥戊酸途徑代謝的一種方法。根據(jù)計算，葡萄糖通過MVA途徑產(chǎn)1分子IPP/DMAPP需要消耗2分子NADPH，而其上游糖酵解途徑能夠合成6分子NADH。通過加強(qiáng)或者敲除相關(guān)基因，可以實現(xiàn)從NADH到NADPH的高效轉(zhuǎn)化，進(jìn)而能夠有效提升MVA途徑合成效率[31]。例如，將釀酒酵母中NADH激酶(tPos5p)轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，催化NADH合成NAD(P)H，同時敲除yjgB基因(圖3)，使得原油烯的產(chǎn)量由10.4 mg/L提高到512.7 mg/L[15]。

圖3 輔助因子的協(xié)調(diào)Fig.3 Coordination of cofactors

總體來說，輔因子的協(xié)調(diào)策略主要集中在MEP途徑。根據(jù)MVA與MEP途徑的化學(xué)計量分析，在產(chǎn)萜類化合物的過程中，1.5分子的葡萄糖經(jīng)過MVA途徑會產(chǎn)生4分子的NAD(P)H，而1分子葡萄糖經(jīng)過MEP途徑需要消耗2分子NAD(P)H。

鑒于目前多數(shù)代謝工程菌株大多是同時利用MVA途徑和MEP途徑生產(chǎn)萜類化合物，如何利用NAD(P)H的轉(zhuǎn)化和調(diào)控協(xié)調(diào)好微生物體內(nèi)MVA途徑與MEP途徑的效率，是以后研究的重要方向。

3 競爭途徑的調(diào)控

甲羥戊酸下游途徑與微生物的生長代謝途徑密切相關(guān)，兩者對碳源存在依賴與競爭關(guān)系。為了提高萜類化合物的產(chǎn)量，需從支路途徑和競爭途徑重新定向碳通量。阻斷競爭途徑是重新定向碳通量的常用方法，具體控制策略具體包括：a. 敲除其中關(guān)鍵酶基因[16-17]。b. 選擇較弱的啟動子或執(zhí)行RNA干擾[18,21]。c. 動態(tài)控制競爭酶的表達(dá)[21]。d. 酶抑制劑的利用[32]。e. 基因振蕩器的應(yīng)用[33](圖4)。

圖4 阻斷競爭途徑Fig.4 Blocking the competitive pathway

敲除競爭途徑的關(guān)鍵酶基因是常見的代謝工程策略。敲除參與香葉醇向其他萜類化合物內(nèi)源性轉(zhuǎn)化的OYE2(編碼NAD(P)H氧化還原酶)與ATF1(編碼乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因，使更多的碳通量流向到香葉醇的生產(chǎn)：OYE2基因的敲除使其產(chǎn)量為285.9 mg/L，比對照提高了1.7倍；ATF1基因的敲除使其產(chǎn)量達(dá)到了259.8 mg/L，比對照提高了1.6倍[16]。敲除關(guān)鍵基因的優(yōu)點是在阻止中間產(chǎn)物擴(kuò)散或者代謝流向競爭途徑時穩(wěn)定性高，可以有效增加主路徑代謝流。如果競爭途徑參與了細(xì)胞生長代謝，那么敲除關(guān)鍵酶基因會影響細(xì)胞生長，而通過選擇較弱的啟動子或執(zhí)行RNA干擾可以避免這個問題。法尼基焦磷酸(FPP)是合成倍半萜類化合物與鯊烯共同的前體，而鯊烯是合成細(xì)胞膜組分麥角固醇的前體，為了積累更多的FPP用于倍半萜類化合物的合成，可使用弱啟動子PBTS1代替鯊烯合成酶基因ERG9原本的啟動子[21]。RNA開關(guān)為天然核開關(guān)，是一類位于mRNA3’或5’-UTR上的能夠結(jié)合小分子代謝物以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的mRNA元件。它與小分子代謝物的結(jié)合不依賴于任何蛋白質(zhì)，從而使構(gòu)象發(fā)生改變，并在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)[34-36]。對于一些關(guān)鍵的支路途徑，通過采用1個較弱的啟動子或執(zhí)行RNA干擾，既保證了宿主的正常生長又減少了支路途徑的競爭，然而這種策略不能根據(jù)代謝過程中的需求做出實時調(diào)控。利用調(diào)控元件可以實現(xiàn)對競爭途徑代謝流的實時動態(tài)調(diào)控。例如，Xie等[21]將受葡萄糖抑制的改良GAL啟動子調(diào)控合成類胡蘿卜素主路徑基因的表達(dá)，將受葡萄糖誘導(dǎo)的HXT1啟動子調(diào)控競爭路徑ERG9基因的表達(dá)，實現(xiàn)根據(jù)葡萄糖濃度進(jìn)行動態(tài)調(diào)控。動態(tài)調(diào)控策略雖然能夠有效提高微生物發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度和效率，但是由于調(diào)控元件的特異性，這類元件很難廣泛應(yīng)用到其他產(chǎn)品中，而且針對特定的化合物，研究者還需要花費大量時間和精力去開發(fā)、尋找新的調(diào)控元件[37-39]。利用酶抑制劑是一種比較簡單、容易操作的代謝工程策略。Peng等[18]建立了一種序列依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)機(jī)制(富含Pro、Glu/Asp、Ser和Thr)，降低ERG9p的水平，使倍半萜(nerolidol)產(chǎn)量達(dá)到100 mg/L，提高了86%。盡管酶抑制劑方法簡單易操作，但是也具有抑制劑選擇難度大等局限性，限制了其廣譜性的應(yīng)用?；蛘袷幤餮b置也是目前采用的一種新型策略，作為一種基因調(diào)控裝置，通過基因振蕩器的幅度和周期來決定基因表達(dá)的時間[33]。這種對基因表達(dá)時間的控制，可以用在大規(guī)?；蚓W(wǎng)絡(luò)中，同時僅利用少量的調(diào)控因子即可調(diào)控相對較多的基因，從而實現(xiàn)對復(fù)雜細(xì)胞行為的調(diào)控。此外，動態(tài)調(diào)控策略還需要綜合考慮轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平后進(jìn)一步完善。由此可見，調(diào)控策略各有利弊，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于目標(biāo)萜類化合物的生產(chǎn)中，但是如何根據(jù)具體需求選擇最佳調(diào)控方法將效率調(diào)控至最佳依然是目前的研究難點。

4 宿主的進(jìn)化

通過前體物質(zhì)供應(yīng)和輔助因子的協(xié)調(diào)、競爭途徑的調(diào)控直接作用于甲羥戊酸路徑的支路，對菌株萜類化合物的生產(chǎn)產(chǎn)生了較大影響。然而，也可通過其他策略間接影響代謝途徑的效率，例如隨機(jī)誘變、定向馴化和系統(tǒng)分析等策略對底盤細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，改造菌株，從而影響代謝途徑的效率。底盤細(xì)胞為萜類化合物的合成提供所需要的合成場所，而且萜類化合物的合成途徑與底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)之間具有非常復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。因此，可以采用隨機(jī)誘變、定向馴化和系統(tǒng)分析等策略優(yōu)化底盤細(xì)胞，間接影響甲羥戊酸路徑的代謝效率，以此提高菌株自身的優(yōu)勢(圖5)。

圖5 宿主細(xì)胞的進(jìn)化Fig.5 Microbial host evolution

隨機(jī)誘變是最常見、操作簡易的進(jìn)化方法。Wang等[23]通過紫外照射突變體UV11-4使細(xì)胞干質(zhì)量增加，然后采用抑制劑二苯胺(DPA)來篩選高產(chǎn)蝦青素的產(chǎn)生菌株。突變體DPA12-2經(jīng)逆變培養(yǎng)、增殖和轉(zhuǎn)化，蝦青素產(chǎn)量是野生型的1.7倍，達(dá)到(47.21±3.30) mg/g。然而，隨機(jī)誘變需要大量的后期篩選工作，通過采用高通量篩選方法可大大提高工作效率[40]。

對于很多化合物的合成，無法建立高通量篩選方法，而定向馴化[41-42]可以解決這個問題。與隨機(jī)誘變相比，定向馴化目的性更強(qiáng)，是一種可以富集、篩選微生物和改變微生物生理性狀的一種有效方法，在菌種選育工作中已有廣泛的應(yīng)用。隨著萜類化合物生產(chǎn)水平的不斷提高，一些終端產(chǎn)品(如蒎烯、檜烯[43]和某些生物燃料)對細(xì)胞的毒性限制了其進(jìn)一步改進(jìn)可能。Brennan等[44]通過定向馴化，以提高宿主對檸檬烯的耐受性，篩選出優(yōu)勢菌株，宿主對檸檬烯耐受性提高了9倍，蒎烯與月桂烯分別提高了11與8倍；通過測序分析發(fā)現(xiàn)，Tcb2p和Tcb3p基因?qū)儆谕蛔兓颍桥c其代謝途徑并無直接關(guān)聯(lián)，主要通過間接代謝調(diào)控改變對有毒物質(zhì)的耐受性。這與大腸桿菌對乙醇[45]和異丁醇[46]的耐受性以及釀酒酵母對木糖[47]和半乳糖[48]的利用率，在作用機(jī)制上有著相似的情況，都是通過間接方式對代謝調(diào)控來提高產(chǎn)物的積累。

隨機(jī)誘變與定向馴化的作用機(jī)制不可控制，屬于非理性策略，在實驗后期有大量的篩選鑒定工作。因此采用計算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)分析，尋找目標(biāo)基因是一種優(yōu)化替代策略。為了促進(jìn)萜類化合物的合成，Zhu等[25]對宿主釀酒酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行計算分析，確定了具有促進(jìn)萜類化合物產(chǎn)生潛力的敲除位點，構(gòu)建了相應(yīng)的單突變體。Sun等[24]最終獲得的突變株產(chǎn)生的阿莫法二烯產(chǎn)量達(dá)到54.55 mg/L，是野生型的12倍。相對來說，隨機(jī)誘變、定向馴化和系統(tǒng)分析，這三種針對宿主細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化的代謝策略都是比較耗時的，并且對甲羥戊酸途徑的的作用機(jī)制尚不明確，但是，通過這3種策略獲得的用于生產(chǎn)改良的突變體和突變基因通常具有創(chuàng)造性和原創(chuàng)性。因此，下一步需要提高篩選工作效率來篩選陽性突變體和基因，并加大對突變后作用機(jī)制的研究。

5 結(jié)論與展望

針對甲羥戊酸途徑的代謝支路調(diào)控，從前體物質(zhì)供應(yīng)和輔助因子的協(xié)調(diào)、競爭途徑的調(diào)控以及間接對代謝調(diào)控產(chǎn)生影響的宿主的進(jìn)化這三個方面闡述了其調(diào)控策略的研究進(jìn)展。這些調(diào)控策略結(jié)合主路徑的代謝調(diào)控，使得萜類化合物生產(chǎn)水平不斷提高，但是想要進(jìn)一步提升合成效率達(dá)到工業(yè)化水平，仍有很多問題需要考慮：①在保證細(xì)胞生長不受影響的基礎(chǔ)上，將上游充足的前體物質(zhì)通量引入甲羥戊酸途徑是以后研究的重要方向。②隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，在下游支路調(diào)控中采用動態(tài)代謝調(diào)控受到越來越多的關(guān)注。但是在實際應(yīng)用中，動態(tài)調(diào)控還需要綜合考慮轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和發(fā)酵水平的影響，對于動態(tài)代謝調(diào)控系統(tǒng)在實驗設(shè)計時，應(yīng)該做進(jìn)一步的優(yōu)化。③甲羥戊酸途徑的代謝主路徑調(diào)控與支路徑調(diào)控對于萜類化合物生產(chǎn)同等重要，如何對主路徑與支路徑優(yōu)化結(jié)合，為更好提高萜類化合的產(chǎn)量是以后研究重點。

綜上所述，隨著新技術(shù)的發(fā)展與調(diào)控方法的日益成熟，對于微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建將逐步完善，萜類化合物生產(chǎn)能力將會得到大幅提高，其生物合成萜類化合物生產(chǎn)成本降低，為萜類化合物的綠色生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。