江蘇－山東沿岸大型綠藻微觀繁殖體時空分布特征研究

繆曉翔，肖潔,2,3，王宗靈,2,3*，李艷,2,3，劉萍,2,3，姜美潔，張學雷,2,3

( 1. 自然資源部第一海洋研究所，山東 青島 266061；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237；3. 自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學與技術重點實驗室，山東 青島 266061)

1 引言

綠潮是大型海洋綠藻脫離固著基后大量增殖引起的一種異常生態(tài)現(xiàn)象，主要發(fā)生在河口、內灣、潮間帶和城市密集的海岸，世界許多沿海國家均有記錄[1–4]。自2007 年以來，我國南黃海海域連續(xù)暴發(fā)以滸苔為優(yōu)勢種的綠潮災害，引起政府部門和科研單位的高度重視[5–7]。2008 年，青島沿海高密度聚集的滸苔綠潮分布面積高達33 000 km2，嚴重威脅了北京奧運會青島奧帆賽的順利進行；其后，每年春、夏季，高生物量漂浮滸苔聚集于南黃海西部、從蘇北淺灘至山東半島南岸海域，給江蘇、山東沿海城市的生態(tài)環(huán)境和旅游經(jīng)濟帶來重大負面影響[6,8]。近10 年來，我國學者對于滸苔綠潮的成因、暴發(fā)過程、動力學機制、環(huán)境要素、原因種滸苔的生物學、生態(tài)學特征等方面，展開了大量的研究[6–7,9–12]。研究發(fā)現(xiàn)南黃海蘇北淺灘是黃海滸苔綠潮的重要起源地，在每年4 月中旬回收紫菜養(yǎng)殖筏架時，大量的附生綠藻被機械清理棄置淺灘，由于滸苔具有很強的漂浮能力，隨潮水運動即形成漂浮綠藻，成為綠潮漂浮生物量的早期來源；海區(qū)豐富的營養(yǎng)鹽促使漂浮綠藻生物量迅速上升，最終在風和海流驅動下向北漂移形成大規(guī)模綠潮[13–14]。這一綠潮的發(fā)生發(fā)展過程已被大量的現(xiàn)場調查、遙感監(jiān)測和模擬研究所證實，但目前對于綠藻微觀繁殖體在綠潮暴發(fā)過程中的作用知之甚少，尤其是在綠潮前期孕育過程中的作用以及對大面積漂浮生物量的貢獻等，尚缺乏定性和定量的研究。

綠藻微觀繁殖體是放散的孢子、配子、合子、不同生長階段的顯微個體及有生長能力的綠藻碎片的統(tǒng)稱[15–16]，其在一些機會主義綠藻暴發(fā)形成藻華的過程中起著重要的作用。Lotze 等[17]發(fā)現(xiàn)綠藻微觀繁殖體對于低溫、高鹽、黑暗等不利環(huán)境條件具有較強的抗逆能力，一年生海藻能在近岸海域形成“繁殖體庫”度過寒冬，并為來年春季生物量短時間內暴發(fā)性增殖、形成藻華提供“種子”。不同于世界上其他海域的綠潮，黃海滸苔綠潮分布范圍廣，從南黃海蘇北淺灘（32°N）到山東半島南岸（36.5°N），從江蘇、山東沿岸（119.5oE）至黃海中部（123oE）均有漂浮生物量聚集，漂浮生物量存在遠距離遷移過程[12,18–19]。前期調查發(fā)現(xiàn)微觀繁殖體的分布和數(shù)量與葉狀體（包括定生與漂浮綠藻）有著密切關系，并存在明顯的時空變化。非綠潮暴發(fā)期，綠藻微觀繁殖體在蘇北淺灘區(qū)及鄰近的近岸海域廣泛分布，種類豐富，其豐度從筏架近岸區(qū)向遠岸及北部海域逐漸降低[20–22]。綠潮暴發(fā)期間，微觀繁殖體隨著漂浮綠藻迅速向北部和遠岸海域擴展，以滸苔為主，其數(shù)量與漂浮生物量存在一定關系[21,23–25]。由此可見，綠藻微觀繁殖體在近岸和遠岸不同海域，無論在種類組成、分布和豐度的動態(tài)變化等方面，均存在顯著差異，但其在大規(guī)模綠潮連年暴發(fā)中的作用、對漂浮生物量的具體貢獻等還有待深入研究。

本研究著眼于近岸海域，在山東－江蘇沿岸設置4 個固定站位，開展周年調查研究，分析近岸水體中綠藻微觀繁殖體的群落結構、豐度等，研究綠潮對近岸水體綠藻微觀繁殖體群落結構的影響，以期為探討近岸海域綠藻微觀繁殖體在綠潮暴發(fā)中的作用提供數(shù)據(jù)支撐。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

在江蘇、山東沿岸設置4 個定點站位（圖1），分別為南通蘇北淺灘調查區(qū)（3 2°2 0′～3 3°2 0′N,121°00′～121°30′E）的竹根沙（ZGS, 32°58′08″N,121°09′20″E）、連云港燕尾港沿岸（YWG, 34°32′18″N,119°41′28″E）、日照嵐山港沿岸（LSG, 35°12′26″N,119°25′01″E），青島海濱第一海水浴場（YY, 36°03′24″N,120°20′15″E）。于2016 年3 月至2017 年3 月，按月進行取樣，每個站位取表層海水4 L，通過孔徑200 μm篩絹過濾掉海水中的藻絲體和大型浮游生物，低溫避光保存帶回實驗室培養(yǎng)。表層海水的溫度、鹽度參數(shù)由多參數(shù)水質儀（YSI, USA）現(xiàn)場讀取。

2.2 綠藻微觀繁殖體培養(yǎng)和計數(shù)

分別取1 L 海水加入到滅菌燒杯中，每升海水加入20 mL PES 培養(yǎng)液（Provasoli′s Enriched Seawater Medium）[26]和1 mL 二氧化鍺（GeO2）（終濃度0.5 mg/mL）以抑制硅藻的生長，然后轉入溫度為16oC、光輻射為80～100 μmol/(m2·s)、光周期為12 L/12 D 的智能人工氣候室（202728-380，寧波江南）中培養(yǎng)。每個站位設3 個平行實驗組，每5 d 更換一次PES 培養(yǎng)液保證微觀繁殖體生長的養(yǎng)分充足。

在培養(yǎng)的過程中，微觀繁殖體不斷附著到燒杯底部和燒杯壁，20 d 左右綠藻幼苗長到約為1～3 cm。借助放大鏡數(shù)出燒杯中附著萌發(fā)綠藻幼苗的數(shù)量，以確定培養(yǎng)海水中綠藻微觀繁殖體的數(shù)量。取樣站位微觀繁殖體的豐度（A，株/L）計算公式：A=N/V（N 為萌發(fā)幼苗的總數(shù)，V 為培養(yǎng)水樣的體積）。

圖 1 江蘇?山東沿岸4 個取樣站位Fig. 1 Four sampling locations along the coasts of Jiangsu and Shandong Provinces

計數(shù)后，用消毒鑷子隨機取出綠藻幼苗，逐一鑒定種類。幼苗數(shù)量少于30 株的實驗組，對所有幼苗進行鑒定；大于30 株的實驗組，隨機挑選30～80 株進行鑒定，占幼苗總數(shù)的10%～80%（平均為30%）。取出的綠藻幼苗用雙蒸水漂洗2～3 次，濾紙吸干表面水分，轉移至1.5 mL 滅菌離心管中冷凍保存，用于DNA 制備。

2.3 藻體幼苗種類和基因型的分子鑒定

全基因組DNA 的提取參照Hwangbo 等[27]的快速提取法并加以改進。具體步驟如下：含有單株藻體的1.5 mL 離心管中，加入100～150 μL 5% chelex 100(BioeRad, USA)螯合劑，手持式勻漿器渦旋勻漿10 s，95oC 或沸水水浴5 min，13 000 r/min 離心1 min 去除組織碎片，將上清液移至新管，即為PCR 擴增所需的模板。綠藻種類鑒定參照Xiao 等[28]，即根據(jù)ITS 序列的PCR-RFLP 分型區(qū)分滸苔（Ulva prolifera）/緣管滸苔（U. linza）與其他常見種（扁滸苔U. compressa、孔石莼U. pertusa、未命名種Ulva sp. 以及盤苔Blidingia sp)，再以5S spacer 片段的長度多態(tài)性區(qū)分滸苔與緣管滸苔。擴增ITS 片段（包括 ITS1，5.8S 以及ITS2）SCAR 和5S 的引物見表1。ITS 擴增產物經(jīng)限制性內切酶BspT107 I 和EcoO109 I（大連寶生物公司）酶切、用溴化乙錠染色的2% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，在c150 成像系統(tǒng)（Azure Biosystem, USA）上顯色觀察。

為進一步追蹤“漂浮生態(tài)型”滸苔微觀繁殖體，采用特異性的SCAR 標記[32]對已經(jīng)鑒定為滸苔的樣品進一步PCR 擴增，引物見表表1，隨機挑選SCARPCR 產物，E.Z.N.A.TM（Omega Bio-Tek, USA）割膠回收并純化，純化產物進行雙向測序（生工生物工程股份有限公司）。部分測序困難的樣品連接至pMDTM19-T（Takara，中國上海）載體，并轉化至感受態(tài)大腸桿菌DA5α，采用麥康凱選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆，經(jīng)PCR 檢測后，送往生工生物工程股份有限公司進行測序。所得序列與已發(fā)表數(shù)據(jù)進行比對[32]，以確定擴增片段的準確性。

2.4 統(tǒng)計分析

應用SPSS 16.0（SPSS Inc.）軟件對培養(yǎng)獲得綠藻微觀繁殖體的豐度差異進行檢驗，首先采用線性插值法補充缺失數(shù)據(jù)，不同季節(jié)和站位的差異性比較通過雙因素方差分析（two-way ANOVA）得到，兩個站位之間的差異性比較通過獨立t-檢驗（independent t-test）得到。通過Shapiro-Wilks 方法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，Levene 法對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。

3 結果

3.1 綠藻微觀繁殖體豐度與時空分布

江蘇－山東沿岸4 個站位，水體中微觀繁殖體的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的時空分布特征。整體而言，ZGS 和YY 微觀繁殖體豐度高于YWG 和LSG，LSG 豐度最低（two-way ANOVA，F(xiàn)=8，P＜0.05），4 個站位年平均豐度分別為77 株/L、79 株/L、49 株/L、6 株/L。春季（2016 年3 月－5 月），ZGS 微觀繁殖體數(shù)量（平均152 株/L）明顯高于YY（平均86 株/L）（independent ttest，P＜0.05，圖2），6 月和10 月，ZGS 數(shù)量（平均29 株/L）顯著下降，且遠低于YY（平均132 株/L）（independent t-test，P＜0.05）；其他月份（11 月至翌年2 月），ZGS 微觀繁殖體數(shù)量（平均55 株/L）與YY（平均39 株/L）無明顯區(qū)別（independent t-test，P＞0.05）。

各站位水體綠藻微觀繁殖體豐度呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性波動。ZGS 站最低值為19 株/L，最高值為249 株/L，其數(shù)量在春季（3?4 月份）快速增長，5 月達到峰值249 株/L（SE=48 株/L，SE 為標準誤差），隨后快速下降，深秋（11 月份）達到次高峰120 株/L（SE=12 株/L），冬季（12 月至翌年2 月）數(shù)量較低，為27～40 株/L。

YWG 和LSG2 個站位變化趨勢大體一致，7 月份為峰值，平均微觀繁殖體數(shù)量最高，隨后微觀繁殖體數(shù)量處于下降趨勢，8 月份為低點，11 月份LSG 微觀繁殖體數(shù)量達到另一個次高峰，冬季（1 月份）平均微觀繁殖體數(shù)量最低。YWG 水體中微觀繁殖體數(shù)量（0～15 株/L，平均6 株/L）遠低于LSG（4～150 株/L，平均49 株/L），約為LSG 的12.2%。

表 1 引物序列及參考文獻Table 1 Sequences and references of the primers used in the study

YY 站位微觀繁殖體數(shù)量峰值出現(xiàn)在6 月，達到184 株/L（SE=36 株/L），隨后微觀繁殖體數(shù)量一直處于下降趨勢，到9 月份進入低點，為29 株/L（SE=6 株/L），秋季（11 月）微觀繁殖體數(shù)量又達到一個次高峰，為110 株/L（SE=40 株/L），冬季（1 月份）平均微觀繁殖體數(shù)量最低，僅18 株/L（SE=6 株/L）。

3.2 微觀繁殖體種類組成與演替

ZGS 和YY 兩個站位一共檢測綠藻幼苗510 株，種類包括緣管滸苔U. linza、滸苔U. prolifera、滸苔屬未知種Ulva sp.、扁滸苔U. compressa、盤苔Blidingia sp.和孔石莼U. pertusa 6 種。緣管滸苔為優(yōu)勢種，全年均有出現(xiàn)，占比最高，兩個站位年平均達56.3%（圖3）。滸苔亦為常見種，平均占比20.0%，但其豐度呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性波動。ZGS 站，5－6 月和10 月，滸苔豐度較高，占比為40.0%～66.7%，其余月份比例較低，占比為7.7%～37.5%，在冬季亦能維持一定數(shù)量。YY 站波動更為顯著，7 月份滸苔微觀繁殖體豐度陡然增高，7?9 月份比例高達20.0%～78.6%，其余月份零星出現(xiàn)，占比0%～17.1%。Ulva sp.微觀繁殖體數(shù)量平均為11.6%，孔石莼、扁滸苔和盤苔這3 種綠藻微觀繁殖體數(shù)量明顯較少，平均所占比例分別為8.0%、3.1%和1.0%。

3.3 滸苔微觀繁殖體組成變化

對于鑒定出的102 株滸苔，用特異性SCAR 分子標記進一步區(qū)分其基因型。隨機挑選10 個“漂浮生態(tài)型”滸苔陽性樣本進行測序檢驗，測序結果與文獻[32]中的序列相似度達100%，說明本研究中檢測出的“漂浮生態(tài)型”滸苔微觀繁殖體與綠潮漂浮滸苔基因型一致。統(tǒng)計其數(shù)量與比例發(fā)現(xiàn)，在ZGS 站，滸苔全年存在，5 月為最高峰，達105 株/L，2 月為最低峰；“漂浮生態(tài)型”滸苔占據(jù)絕對優(yōu)勢，比例高達50.0%～100.0%，全年平均占比81.7%（圖4）。YY 站，滸苔微觀繁殖體在7 月份陡然增高，達132 株/L，然后迅速下降，持續(xù)到9 月份（19 株/L），在其他月份零星存在；與ZGS 站不同的是，“漂浮生態(tài)型”滸苔只存在于7、8 月份，占滸苔微觀繁殖體數(shù)量的37.5%～90.9%，其他月份未檢測出。

4 討論

本研究對江蘇－山東沿岸水體中大型綠藻微觀繁殖體進行周年監(jiān)測，通過室內培養(yǎng)和分子檢測相結合的手段，研究微觀繁殖體的豐度和種群結構演替。研究發(fā)現(xiàn)江蘇ZGS 和青島YY 近岸水體中綠藻微觀繁殖體豐度較高，而連云港YWG 和日照LSG 站豐度較低；各站位微觀繁殖體群落結構均具有較高的物種多樣性，并存在明顯的季節(jié)性波動；“漂浮生態(tài)型”滸苔在ZGS 周年存在，并保持較高的比例。

圖 2 2016 年3 月至2017 年3 月江蘇?山東沿岸各站位綠藻微觀繁殖體數(shù)量變化（平均值±標準誤差，*代表未采樣）Fig. 2 Micro-propagule abundance at four sampling locations along the coasts of Jiangsu and Shandong provinces from March 20016 to March 2017 (mean±SE, * indicates no samples collected)

江蘇、山東近岸水體中綠藻微觀繁殖體物種多樣性水平較高，滸苔屬和盤苔屬常見種類均有檢測出，包括6 種：緣管滸苔U. linza、滸苔U. prolifera、扁滸苔U. compressa、孔石莼U. pertusa、Ulva sp.和盤苔Blidingia sp.[28,33–35]。緣管滸苔作為優(yōu)勢種全年廣泛分布于各站位，這與緣管滸苔的孢子在惡劣的環(huán)境中具有很強的耐受能力，更容易適應弱光條件等有關[36]。另外，田曉玲等[33]和劉峰等[37]發(fā)現(xiàn)江蘇如東近岸和淺灘海區(qū)存在尾孢藻屬（Urospora）綠藻。根據(jù)Urospora spp.序列，我們亦分析了其酶切圖譜并在檢測過程中加以比對，本研究培養(yǎng)的樣本中并未檢測出尾孢藻，這可能與采用的培養(yǎng)方法與條件有關。眾多研究表明，綠藻對溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽、光照等環(huán)境條件比較敏感，不同條件會導致其萌發(fā)生長等生理活動的改變[38–43]。在對黃海滸苔綠潮的長期追蹤和研究中，本課題組保持一致的培養(yǎng)條件，以增加數(shù)據(jù)的可重復性和可比較性。本研究亦設置13 個月的采樣培養(yǎng)，其中3 月份連續(xù)兩年的實驗數(shù)據(jù)（包括微觀繁殖體豐度和組成）無顯著差異（independent t-test，P＜0.05），證明本研究實驗方法與結果的可靠性與可重復性。

ZGS 站水體中綠藻微觀繁殖體豐度和種類組成研究表明，蘇北淺灘區(qū)是綠潮原因種滸苔繁殖體越冬并維持種群的重要區(qū)域。早期一系列研究顯示，淺灘及鄰近海域水體和底泥中周年存在較高數(shù)量的綠藻微觀繁殖體[21,23,25]，對培養(yǎng)樣本的隨機測序結果顯示，該海域存在滸苔微觀繁殖體[44–45]，推測淺灘海域廣布的滸苔繁殖體構成了黃海滸苔綠潮連年爆發(fā)的“種子庫”[20–21,25,37]。隨后，Zhao 等[32]發(fā)現(xiàn)形成綠潮的漂浮滸苔群體具有高度的遺傳均一性，并開發(fā)了快速區(qū)分“漂浮”滸苔生態(tài)型的SCAR 分子標記，成為追蹤綠潮滸苔原始定生種群和微觀繁殖體“種子庫”等的重要手段[46–47]。本研究定量分析了淺灘區(qū)水體綠藻微觀繁殖體豐度和種類組成，發(fā)現(xiàn)該海域綠藻微觀繁殖體豐度較高，且滸苔微觀繁殖體周年存在；并進一步定量化滸苔和“漂浮生態(tài)型”滸苔微觀繁殖體種群數(shù)量及占比，發(fā)現(xiàn)淺灘區(qū)滸苔微觀繁殖體中“漂浮生態(tài)型”占據(jù)極大優(yōu)勢（占比50.0%～100%）。本研究結果進一步證實了前期推測，淺灘海域是滸苔微觀繁殖體的重要“棲息地”，在維持滸苔種群中起著重要作用。

圖 3 2016 年3 月至2017 年3 月ZGS 和YY 站綠藻微觀繁殖體種類組成（*代表未采樣）Fig. 3 Species composition of the mciro-propagule communities at ZGS and YY stations from March 2016 to March 2017 (* indicates no samples collected)

與蘇北淺灘ZGS 站相比，青島YY 水體中綠藻微觀繁殖體群落演替呈現(xiàn)截然不同的季節(jié)性變化特征。徐福祥等[48]遙感監(jiān)測結果，2016 年7 月初大規(guī)模漂浮綠藻登陸青島，8 月初逐步消失；與此對應，夏季（7－8 月）大規(guī)模綠藻到達青島海濱時，青島近岸水體綠藻微觀繁殖體種類發(fā)生劇烈變化，優(yōu)勢種從緣管滸苔轉變?yōu)闈G苔，并且“漂浮生態(tài)型”滸苔微觀繁殖體大量出現(xiàn)；而在其他季節(jié)未有大規(guī)模漂浮綠潮時，滸苔微觀繁殖體始終處于低值，冬季未檢測到“漂浮生態(tài)型”滸苔微觀繁殖體，此結果與Zhao 等[35]2014－2015 年檢測結果完全一致。這些研究表明青島本地微觀繁殖體群落結構受到大規(guī)模漂浮滸苔的季節(jié)性擾動，其組成結構在綠潮暴發(fā)期會發(fā)生顯著變化，但影響較為短暫。

上述不同海域監(jiān)測結果對比發(fā)現(xiàn)，蘇北淺灘在維持綠潮滸苔種群、引發(fā)黃海大規(guī)模綠潮連年暴發(fā)中起著重要作用。但對于滸苔種群如何在淺灘海域維持其種群、淺灘區(qū)具體哪些環(huán)境因素起重要作用等，尚未有深入的研究。前期研究顯示，淺灘海域大量筏架設施[49]、充足的營養(yǎng)鹽供給[50]、春季快速升高的水溫和光照條件等[44]，對滸苔微觀繁殖體附著萌發(fā)形成新的生物量提供了有利條件。然而，綠潮滸苔維持其種群數(shù)量的內在因素與外在條件等，還需要進一步研究。Zhao 等[35]從青島沿海定生綠藻群體中檢測到極少量（約0.3%）“漂浮生態(tài)型”滸苔樣本，推測在長期漂浮滸苔大規(guī)模侵入以及綠潮期間大量滸苔微觀繁殖體釋放等壓力下，“漂浮生態(tài)型”滸苔存在一定的北侵風險。該研究強調了進一步長期監(jiān)測江蘇－山東近岸海域環(huán)境中綠藻微觀繁殖體的必要性，受全球氣候變化和人類活動的影響，黃海近岸海域生態(tài)環(huán)境正逐步改變，如：海水表層溫度上升[51]，條斑紫菜養(yǎng)殖遷移（南菜北養(yǎng)）[52]，加上養(yǎng)殖業(yè)和工業(yè)的快速發(fā)展，營養(yǎng)鹽水平普遍升高[53–54]等，是否對滸苔微觀繁殖體種群維持與變化產生了影響，值得深入研究。

圖 4 2016 年3 月至2017 年3 月ZGS、YY 站滸苔微觀繁殖體豐度及“漂浮生態(tài)型”滸苔占比（*代表未采樣）Fig. 4 Abundance of the total and ‘floating’ type of U. prolifera at ZGS and YY stations from March 2016 to March 2017 (* indicates no sample collected)