實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析中不同鐵濃度處理下瑪氏骨條藻內(nèi)參基因的篩選

張梅，邢永澤，甄毓*，米鐵柱，于志剛

( 1. 中國海洋大學(xué) 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3. 中國海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；4. 中國海洋大學(xué) 海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

1 引言

骨條藻（Skeletonema spp.）屬于海鏈藻目（Thalassiosirales）、骨條藻科（Skeletonemataceae），是我國近海海域常見、數(shù)量多、分布范圍極廣的一類海洋浮游硅藻，有時(shí)會(huì)引發(fā)赤潮。由于不同骨條藻種類之間的形態(tài)學(xué)差異十分細(xì)微，準(zhǔn)確鑒定的難度相對(duì)較大。因此，前些年國內(nèi)的研究者通常將我國近海海域的骨條藻都定名為中肋骨條藻（Skeletonema costatum）并對(duì)其進(jìn)行研究[1]。近些年來，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為骨條藻的種類鑒定和遺傳多樣性研究提供了可靠的技術(shù)保證。到目前為止，我國近海海域共發(fā)現(xiàn)10 種骨條藻，分別為瑪氏骨條藻（S. marinoi）、中肋骨條藻（S. costatum）、擬中肋骨條藻（S. pseudocostatum）、熱帶骨條藻（S. tropicum）、曼式骨條藻（S. menzelii）、江河骨條藻（S. potamos）、多恩骨條藻（S. dohrnii）、敏鹽骨條藻（S. subsalsum）、桂氏骨條藻（S. grevillei）和亞當(dāng)斯骨條藻（S. Ardens）[2]。隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸將目光聚焦在了單種骨條藻的研究上。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）是定量分析基因表達(dá)的一種有效、精確的方法，具有重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[3–4]。然而，在其分析過程中，RNA 的質(zhì)量和完整性、反轉(zhuǎn)錄效率、引物的特異性和擴(kuò)增效率以及其他阻礙因素都會(huì)對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確定量產(chǎn)生影響[5]。因此，需要選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性[6–7]。目前，常用的內(nèi)參基因有很多，包括細(xì)胞色素b（cytochrome b,Cyt b）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（elongation factor 1 alpha, EF-1α）、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin C,UBC）、甘油醛磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate, GAPDH）、β-肌動(dòng)蛋白（actin beta, β-actin）、β-微管蛋白（tubulin beta, β-tubulin）、18S 核糖體RNA（18S rRNA）和25S 核糖體RNA（25S rRNA）等。一個(gè)理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在任何細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)，但是迄今為止，并沒有發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)內(nèi)參基因在所有實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)都是穩(wěn)定的。所研究的物種類型、組織結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)發(fā)育階段以及實(shí)驗(yàn)條件都會(huì)對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[8–10]，因此，需要對(duì)不同實(shí)驗(yàn)體系中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)與鑒定，以便篩選出合適的內(nèi)參基因。

研究者分析了兩種擬菱形藻Pseudo-nitzschia multistriata 和Pseudo-nitzschia arenysensis 的9 個(gè)內(nèi)參基因（RPS、H4、TUB A、TUB B、TBP、CDK A、GAPDH、ACT、COPA）在不同樣本（不同生長(zhǎng)時(shí)期、氮脅迫以及不同菌株）中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，TUB A、TUB B 和CDK A 在所有樣本中的表達(dá)比較穩(wěn)定。就物種本身而言，TUB A、TUB B、CDK A、ACT 和COPA 在P. multistriata 中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，而TUB A、TUB B、CDK A、GAPDH、H4 以及 RPS 則在P.arenysensis 的表達(dá)穩(wěn)定性較高[11]。在評(píng)估低溫、不同光照強(qiáng)度以及不同晝夜周期培養(yǎng)條件下微擬球藻（Nannochloropsis sp.）的內(nèi)參基因（ACT1、ACT2、

TUA、TUB、EF1-α、GAPDH、UBQ、HIS、CYP、UBCE、18S、rbcL）時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)條件的差異會(huì)造成最佳內(nèi)參基因的不同。該研究還發(fā)現(xiàn)ACT2 在所有樣品中的表達(dá)最為穩(wěn)定，但在單獨(dú)處理組中卻并不穩(wěn)定，而18S 在所有樣品中的表達(dá)最不穩(wěn)定，但在低溫處理組中的表達(dá)最為穩(wěn)定[12]。另有研究分析了綠潮原因種緣管滸苔（Ulva linza）的10 個(gè)內(nèi)參基因（ACT1、

ACT2、H2、H3、TUB1、TUB2、UBQ、EF1α、GAPDH、18S）在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)不同鹽度和紫外線處理組的最佳內(nèi)參基因?yàn)門UB2，H2 在不同溫度和干燥脅迫下均能穩(wěn)定表達(dá)，而18S 在不同光照強(qiáng)度處理組表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定表達(dá)性。值得一提的是，在上述基因中并沒有發(fā)現(xiàn)適用于分析所有樣本的內(nèi)參基因[13]。綜上所述，內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)體系中的表達(dá)穩(wěn)定性不同，根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的內(nèi)參基因十分重要。

鐵元素是葉綠體電子傳遞系統(tǒng)一個(gè)重要的輔助因子[14]，它會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而對(duì)光合器官碳固定、電子傳遞以及光利用的能力產(chǎn)生影響[15–17]。研究發(fā)現(xiàn)，高鐵濃度條件下小球藻Chlorella sorokiniana 的細(xì)胞密度顯著高于低鐵組，且參與細(xì)胞生長(zhǎng)的碳酸酐酶（carbonic anhydrase, CA）以及與脂質(zhì)合成相關(guān)的乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase,ACCase）和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體（choline transporter, CT）基因的表達(dá)量均有所增加，這說明鐵離子濃度的增加不僅會(huì)影響細(xì)胞的碳固定，還可能會(huì)影響碳的流向[18]。目前，關(guān)于鐵培養(yǎng)條件下微藻內(nèi)參基因篩選的研究較少，Actin 和泛素連接酶（ubiquitin ligase, UBL）基因是較為常見的內(nèi)參基因[19–20]。為了研究不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻碳固定相關(guān)功能基因的表達(dá)情況，十分有必要對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。為此，本研究選取7 個(gè)候選內(nèi)參基因，包括Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin 以及β-tubulin，采用qRT-PCR 技術(shù)，結(jié)合geNorm[21]、NormFinder[22]和BestKeeper[23]3 個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)它們?cè)诓煌F處理?xiàng)l件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)，以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC1、PEPC2）基因?yàn)槟康幕?，采??ΔΔCt法[24]來驗(yàn)證評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期篩選出合適的內(nèi)參基因，為后續(xù)瑪氏骨條藻碳固定相關(guān)功能基因的研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 瑪氏骨條藻的培養(yǎng)

瑪氏骨條藻（Skeletonema marinoi）保存于中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室，以f/2 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，光照周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為80～100 μmol/ (m2·s)，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取少量處于指數(shù)生長(zhǎng)中期的瑪氏骨條藻，離心去除培養(yǎng)液，將收集得到的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接于不同濃度Fe3+（用FeCl3·6H2O 配制）的培養(yǎng)基中，共設(shè)5 個(gè)處理組，添加的Fe3+濃度分別為：1.5 μmol/L、3.0 μmol/L、6.0 μmol/L、12.0 μmol/L、24.0 μmol/L，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。其中，培養(yǎng)容器為500 mL 容量瓶，培養(yǎng)體積為400 mL。為了保證無菌環(huán)境，在培養(yǎng)起始時(shí)加入終濃度為50 mg/L 的氨芐青霉素。每天定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞密度，細(xì)胞密度的測(cè)定利用光密度法（680 nm）來完成，根據(jù)測(cè)定的吸光度值，結(jié)合已經(jīng)繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）來計(jì)算。待細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后（培養(yǎng)第11 天），離心收集藻細(xì)胞，液氮速凍后?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品總RNA 的提取和cDNA 的合成

參照Trizol reagent（Invitrogen，美國）試劑說明書對(duì)不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的總RNA進(jìn)行提取。利用DS-11 超微量紫外可見分光光度計(jì)（DeNovix, 美國）和1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，待檢測(cè)質(zhì)量合格后，每個(gè)樣品選取400 ng 總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國）進(jìn)行基因組DNA 的去除和cDNA 的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得的cDNA 樣品保存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證

根據(jù)瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（原始序列已提交至https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，登陸號(hào)為：GSE77468），獲取Cytb、EF-1α、PEPC1 以及PEPC2 等9 個(gè)基因的序列，利用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)好的引物交由北京六合華大基因有限公司合成，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用20 μL 體系：1 μL 模板cDNA，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，10 μL 2×Easy TaqPCR super mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國），7 μL 無菌水。每個(gè)樣本設(shè)置2 個(gè)平行，反應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（2%）凝膠電泳檢測(cè)，觀察電泳條帶是否單一，如若單一，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和其對(duì)應(yīng)的引物送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)PCR 產(chǎn)物是否為目的片段。

2.4 qRT-PCR 的反應(yīng)條件的設(shè)置

采用SYBR GreenⅠ染料法，在7500 Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。采用20 μL 體系：10 μL Fast-Start Universal SYBR Green Master（Roche, 瑞士），正、反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，0.2 μL BSA（20 mg/mL），2 μL cDNA，6.6 μL 的滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，53℃（56℃，60℃）退火延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照。引物的退火溫度根據(jù)熔解溫度（Tm值）來進(jìn)行設(shè)置，其中，Cytb 的退火溫度為53℃，UBC、GAPDH、HPRT 以及PEPC2 的退火溫度為56℃，其余4 個(gè)基因的退火溫度為60℃。

2.5 引物擴(kuò)增效率的計(jì)算

利用稀釋模板cDNA 的方法，通過qRT-PCR 反應(yīng)獲得不同濃度梯度下各個(gè)反應(yīng)的Ct 值，計(jì)算引物的擴(kuò)增效率。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：等量移取15 個(gè)樣品的cDNA，充分混合后依次稀釋7 個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋2 倍，則濃度分別為原液的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 和1/64。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照。以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值和樣本的平均Ct 值分別作為橫、縱坐標(biāo)做直線擬合分析，得到斜率k 和確定系數(shù)R2。根據(jù)公式A=10?1/k?1，計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率A。

2.6 數(shù)據(jù)的處理與分析

讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct 值，計(jì)算出單個(gè)候選內(nèi)參基因在每個(gè)樣品中的平均值（Ct′），利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同鐵濃度培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定表達(dá)系數(shù)。其中，BestKeeper 軟件可以直接對(duì)Ct′值進(jìn)行分析，而GeNorm 和NormFinder 兩個(gè)軟件需要將Ct′值轉(zhuǎn)化為Q 值（基因的相對(duì)表達(dá)量）后，才可進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)化公式為Q=EΔCt′，其中，ΔCt′為該基因在所有處理組中的最小值減去該基因在各個(gè)處理組樣品中的Ct′值，E=2A，當(dāng)引物的擴(kuò)增效率（A）接近100%時(shí)，E 通常默認(rèn)為2。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長(zhǎng)狀況分析

不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長(zhǎng)曲線如圖2 所示，培養(yǎng)11 d 后，5 個(gè)處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)均已進(jìn)入穩(wěn)定期，離心收集瑪氏骨條藻細(xì)胞樣品，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。由圖2 可知，各組在前5 d 的細(xì)胞密度差異較小，表明此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽較為充足，適合瑪氏骨條藻的生長(zhǎng)。從培養(yǎng)第6 天開始，各組細(xì)胞密度開始出現(xiàn)不同，基本表現(xiàn)為培養(yǎng)液中初始Fe3+濃度越高，細(xì)胞的最終密度則越大。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，1.5 μmol/L、3.0 μmol/L、6.0 μmol/L、12.0 μmol/L、24.0 μmol/L Fe3+處理組的平均生長(zhǎng)速率分別為0.319 d?1、0.324 d?1、0.327 d?1、0.330 d?1以及0.335 d?1，其中，1.5 μmol/L Fe3+處理組的平均生長(zhǎng)速率顯著低于6 μmol/L、12 μmol/L以及24 μmol/L 處理組（p＜ 0.05），而與3 μmol/L 處理組的平均生長(zhǎng)速率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。同時(shí)，3 μmol/L、6 μmol/L 和12 μmol/L 處理組的平均生長(zhǎng)率并無顯著差別，但前兩者的平均生長(zhǎng)率卻顯著低于24 μmol/L 處理組，而后者與24 μmol/L 處理組并無顯著差別。簡(jiǎn)而言之，F(xiàn)e3+濃度的升高從一定程度上可以促進(jìn)瑪氏骨條藻的生長(zhǎng)。

圖 1 吸光度值與瑪氏骨條藻細(xì)胞密度的線性關(guān)系Fig. 1 The linear relationship between absorbance value and cell density of Skeletonema marinoi

3.2 總RNA 的質(zhì)量檢測(cè)

在qRT-PCR 分析中，檢測(cè)RNA 的純度和完整性是十分必要的。使用DS-11 超微量紫外可見分光光度計(jì)（DeNovix，美國）檢測(cè)總RNA 的濃度和純度。檢測(cè)結(jié)果表明，15 個(gè)樣品的A260/A280在1.85～1.98 之間，說明RNA 的純度較高；其中260 nm 是核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，280 nm 是蛋白質(zhì)的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，發(fā)現(xiàn)能夠較為清晰的顯示3 個(gè)條帶，由上到下分別為28SRNA、18SRNA 以及small RNAs 條帶，這說明RNA 的質(zhì)量較好，基本沒有發(fā)生降解，可滿足后續(xù)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)的要求。

3.3 引物特異性驗(yàn)證和擴(kuò)增效率的測(cè)定

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)9 對(duì)引物分別設(shè)置陰性對(duì)照，利用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)上述PCR 的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各對(duì)引物的擴(kuò)增片段電泳條帶單一且清晰，無彌散現(xiàn)象，且所有的陰性對(duì)照結(jié)果均為陰性，圖3a、圖3b 中展示的分別是Cytb、PEPC1 基因的陰性對(duì)照結(jié)果。將PCR產(chǎn)物和其對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與原基因序列BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PCR 產(chǎn)物與原基因序列高度一致，表明這些引物均能成功進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。

以2 倍濃度梯度稀釋的cDNA 為模板，進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增，根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合分析，從而獲得9 個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示上述9 個(gè)基因的確定系數(shù)R2≥0.984。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k 帶入公式A=10?1/k?1，獲得引物的擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示引物的擴(kuò)增效率在99.0%～104.0%之間，符合qRT-PCR 對(duì)擴(kuò)增效率的要求（表1）。同時(shí)，分析各個(gè)基因的熔解曲線發(fā)現(xiàn)，都只產(chǎn)生單一峰，技術(shù)重復(fù)樣品間的曲線重疊性好，陰性對(duì)照組無對(duì)應(yīng)的信號(hào)。上述結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物特異性較強(qiáng)，qRT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果準(zhǔn)確可信。

3.4 內(nèi)參基因的表達(dá)分析

qRT-PCR 分析了7 個(gè)候選內(nèi)參基因在5 個(gè)不同鐵離子濃度處理組的表達(dá)豐度（圖4），結(jié)果顯示，所有候選內(nèi)參基因的Ct 值在19.0～32.3 之間，其中，Cytb、EF-1α 和β-actin 基因的Ct 值較低，分別在19.0～21.0、19.7～21.8 和20.6～22.4 之間；GAPDH 和U B C 基因的C t 值較高，分別在2 6.4 ～3 0.9 和28.9～32.3 之間；而HPRT 和β-tubulin 的Ct 值則分別在23.6～28.5 和24.3～27.1 之間，上述這些結(jié)果說明上述內(nèi)參基因不僅在表達(dá)豐度上存在一定的差異，而且表達(dá)穩(wěn)定性也有所不同。

圖 2 不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Growth curves of Skeletonema marinoi in different concentration of Fe3+ conditions

圖 3 9 個(gè)基因的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of seven reference genes

3.5 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

3.5.1 GeNorm 分析

GeNorm 通過對(duì)內(nèi)參基因在不同處理組中的平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)（average expression stability value, M）進(jìn)行排序來確定最穩(wěn)定表達(dá)的基因，M 值越大，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越低，反之，穩(wěn)定性越好。在分析過程中，逐步排除掉M 值高的基因，然后再重新計(jì)算剩余內(nèi)參基因的M 值，直至篩選出最穩(wěn)定的兩個(gè)內(nèi)參基因。通常認(rèn)為M＜1.5 的內(nèi)參基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。GeNorm軟件的分析結(jié)果表明，7 個(gè)候選內(nèi)參基因的M 值均小于1.5，說明上述7 個(gè)基因的表達(dá)都較為穩(wěn)定。在7 個(gè)候選內(nèi)參基因中，Cytb 和EF-1α 的M 值最低（0.252），說明這兩個(gè)基因的穩(wěn)定性最好；HPRT 的M 值最高（0.786），說明它是所選內(nèi)參基因中最不穩(wěn)定的。根據(jù)M 值的大小對(duì)7 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋篍F-1α=Cytb＞β-tubulin＞β-actin＞UBC＞GAPDH＞HPRT（圖5）。

GeNorm 還可通過引入一個(gè)新的內(nèi)參基因計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子（normalization factor）的配對(duì)變異（pairwise variation）V 值來確定合適的內(nèi)參基因數(shù)目。GeNorm 默認(rèn)的V 值為0.15，即當(dāng)Vn/（n+1）＜0.15 時(shí)，則最適的內(nèi)參基因數(shù)目是n 個(gè)，反之，最適的內(nèi)參基因數(shù)目是(n+1)個(gè)。在本實(shí)驗(yàn)中，V2/3=0.110＜0.15，所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)該選擇2 個(gè)內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻膓RT-PCR 反應(yīng)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化（圖6）。

表 1 qRT-PCR 檢測(cè)中9 個(gè)基因的引物序列及其他相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and other relevant information of nine genes in qRT-PCR

圖 4 不同濃度Fe3+處理組中各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度Fig. 4 The expression abundance of each reference gene in the treatment group with different concentration of Fe3+ conditions

圖 5 GeNorm 分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Fig. 5 The average expression stability value (M) of seven candidate reference genes calculated by GeNorm

3.5.2 NormFinder 分析

NormFinder 的計(jì)算原理與GeNorm 相似，也是先獲得內(nèi)參基因的M 值，再根據(jù)M 值的大小來篩選出最穩(wěn)定表達(dá)的一個(gè)內(nèi)參基因。結(jié)果表明（表2）：不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下，EF-1α 的M 值最低（0.084），說明它的穩(wěn)定性是所選內(nèi)參基因中最好的；HPRT 的M 值最高（0.800），說明它的穩(wěn)定性最差。7 個(gè)候選內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從強(qiáng)到弱排序依次為：EF-1α＞β-tubulin＞Cytb＞UBC＞β-actin＞GAPDH＞HPRT。值得注意的是，NormFinder 和GeNorm 兩個(gè)軟件篩選出來的最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因均為EF-1α，而穩(wěn)定性最差的均為

HPRT。

3.5.3 BestKeeper 分析

BestKeeper 程序是一個(gè)內(nèi)置公式的Excel 表格，通過輸入Ct 值對(duì)各個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在BestKeeper 的輸出結(jié)果中，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）是表征內(nèi)參基因在樣品中表達(dá)穩(wěn)定性的指標(biāo)。內(nèi)參基因穩(wěn)定性的判定原則為：SD 和CV 越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差，通常認(rèn)為SD＜1 的內(nèi)參基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。相關(guān)系數(shù)（r）則表征的是候選內(nèi)參基因與其余內(nèi)參基因的相關(guān)性，是選擇內(nèi)參組合的重要指標(biāo)，r 越大，說明該基因與其他基因的相關(guān)性越高，適合同其他內(nèi)參基因協(xié)同作為內(nèi)參組合。BestKeeper 的分析結(jié)果（表3）顯示：βactin 在不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻樣品中的表達(dá)比較穩(wěn)定（SD 為0.23），適合作為qRT-PCR 反應(yīng)的內(nèi)參基因，而GAPDH 的SD 值為1.03，其穩(wěn)定性較差，不適合被用作內(nèi)參基因。7 個(gè)內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從強(qiáng)到弱排序依次為：β-actin＞Cytb＞EF-1α＞β-tubulin＞UBC＞HPRT＞GAPDH。相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果顯示，EF-1α 和β-tubulin 最適合與其他內(nèi)參基因協(xié)同作為內(nèi)參組合，隨后是UBC、Cytb、GAPDH 和HPRT，而β-actin 最不適合。

3.6 內(nèi)參基因的確定

利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件對(duì)不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻7 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明這些候選內(nèi)參基因的排序結(jié)果略有差異，這可能是由于軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同導(dǎo)致的。這種現(xiàn)象在黃瓜（Cucumis sativus）[25]、亞麻（Linum usitatissimum）[26]以及柑橘（Citrus genotypes）[27]等植物的研究中也曾出現(xiàn)過?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們對(duì)每種軟件分析得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序并給予賦值，表達(dá)穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱依次賦值為1、2、3、4、5、6 和7，然后對(duì)3 種軟件的分析結(jié)果（表4）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示EF-1α 得分最低，Cytb次之，隨后是β-tubulin、β-actin、UBC 以及GAPDH，而HPRT 的得分最高。因此，可以認(rèn)為在不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下，瑪氏骨條藻7 個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)椋篍F-1α＞Cytb＞β-tubulin＞β-actin＞UBC＞GAPDH＞HPRT。綜合來看，EF-1α 和Cytb 基因的穩(wěn)定性較好。

表 2 NormFinder 分析7 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Table 2 The average expression stability value (M) of seven reference genes calculated by NormFinder

表 3 BestKeeper 分析7 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Table 3 The average expression stability value（M）of seven reference genes calculated by BestKeeper

圖 6 內(nèi)參基因的配對(duì)變異分析Fig. 6 Analysis pairwise variations of reference genes

在qRT-PCR 分析中，使用不理想的內(nèi)參基因會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來偏差[28]，同時(shí)，只使用單一內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化，也會(huì)給結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度帶來影響[29]。為了消除單一內(nèi)參基因所帶來的定量偏差，Schmid 等[30]建議在標(biāo)準(zhǔn)化過程中至少使用2 個(gè)內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正。前已述及，GeNorm軟件的配對(duì)變異（pairwise variation）V 值結(jié)果表明最佳的內(nèi)參基因數(shù)為2，通過上述分析發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定表達(dá)的兩個(gè)基因?yàn)镋F-1α 和Cytb。同時(shí)，EF-1α 和Cytb 的相關(guān)系數(shù)（分別為0.97 和0.88）均較大，適合同其他基因協(xié)同作為內(nèi)參基因。因此，建議選擇（EF-1α+Cytb）的內(nèi)參組合進(jìn)行不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下目的基因的校正。

3.7 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）廣泛存在于植物中，是一種細(xì)胞質(zhì)酶，其催化C4光合作用固定CO2的起始反應(yīng)。我們?cè)诂斒瞎菞l藻轉(zhuǎn)錄組里發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)PEPC 基因，分別命名為PEPC1 和PEPC2。為了驗(yàn)證不同內(nèi)參基因?qū)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用2?ΔΔCt法，分別以7 個(gè)內(nèi)參基因和穩(wěn)定性最佳的組合（EF-1α+Cytb）為內(nèi)參基因，分析PEPC1 和PEPC2 在不同鐵濃度處理組中的表達(dá)模式。由圖8可知，以（EF-1α+Cytb）、Cytb 或EF-1α 為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因在不同濃度鐵離子處理組的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，表明Cytb 和EF-1α 這兩個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好，而以GADPH、HPRT 等基因?yàn)閮?nèi)參基因時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)目的基因的相對(duì)表達(dá)量與前三者存在明顯的差別，表明這些基因在不同鐵離子處理組的表達(dá)穩(wěn)定性較差，不適合作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻南鄬?duì)表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確校正。上述結(jié)果說明，運(yùn)用qRT-PCR 分析目的基因時(shí)選用不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會(huì)錯(cuò)誤估計(jì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，由此可見，篩選合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

4 結(jié)論

本研究中，Cytb 和EF-1α 基因的穩(wěn)定性最好。Cytb 是線粒體自身編碼的為數(shù)不多的功能蛋白之一，其參與呼吸鏈的電子傳遞，在細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮著重要的作用[31]。何閃英等[32]在研究增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量與中肋骨條藻生長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cytb 基因表達(dá)量變化較小，可以作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正。EF-1α 是一種多功能蛋白，其與多種重要的細(xì)胞學(xué)過程密切相關(guān)，包括細(xì)胞骨架組成、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯控制及細(xì)胞凋亡等[33]。研究發(fā)現(xiàn)，在梧桐（Firmiana simplex）種子[34]和黑麥草（Lolium perenne）[35]的不同發(fā)育階段、楊樹（Populus L.）[36]和黃瓜（Cucumis sativus）[25]不同組織中EF-1α 基因的表達(dá)較為穩(wěn)定，這說明在某些特定條件下，EF-1α 基金適合作為基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因。本研究中β-tubulin、β-actin、UBC、GADPH 等基因的穩(wěn)定性較差，在其他研究中既發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，也發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。輻射條件下，β-tubulin、β-actin 以及GADPH 在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的表達(dá)比較穩(wěn)定，而UBC 的穩(wěn)定性較差[37]，但在對(duì)短柄草（Brachypodium distachyon）的研究中卻發(fā)現(xiàn)UBC 的穩(wěn)定性較好[38]。對(duì)毛果楊（Populus trichocapra）而言，β-tubulin 在不同組織中穩(wěn)定性最差，GADPH 在鋅脅迫的組織中表達(dá)最不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因[39]?？梢姡瑯拥膬?nèi)參基因在不同物種或?qū)嶒?yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性存在顯著差異。因此，應(yīng)該根據(jù)樣品的類型篩選合適的內(nèi)參基因進(jìn)行目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化。

近些年來的研究表明，傳統(tǒng)的單一內(nèi)參基因會(huì)給結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度帶來不良影響，因此建議選擇內(nèi)參基因組合對(duì)目的基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[21]。吳文凱等[40]研究發(fā)現(xiàn)，以不同看家基因構(gòu)成的多內(nèi)參基因組合可能更有利于單細(xì)胞綠藻目的基因的相對(duì)表達(dá)分析。Shim 等[41]分析了紅藻Bostrychia moritziana 的11 個(gè)內(nèi)參基因（EF-1α、GAPDH、ACTB、PUB、30S、60S、TUBB、TUBA、TIF、UbCE、cdH）在不同生活史階段（雄性、雌性、果孢子體和四分孢子體）的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，GAPDH 和30S 的組合更能保證目的基因相對(duì)表達(dá)的準(zhǔn)確性。Liu 等[42]為冰凍脅迫條件下南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L 篩選內(nèi)參基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用RPL19 和GAPDH 的內(nèi)參基因組合有助于獲得更加精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在了湛江等邊金藻（Isochrysis zhangjiangensis）的分析結(jié)果中，研究發(fā)現(xiàn)在氮脅迫條件下，ACT 和TUB 的內(nèi)參基因組合是研究目的基因表達(dá)最可行的內(nèi)控方法[43]。上述結(jié)果表明，使用內(nèi)參基因組合有助于獲得更加精確的分析結(jié)果。從本研究的結(jié)果來看，HPRT、UBC、GAPDH、β-actin 以及β-tubulin 的穩(wěn)定性較差，不適合用作鐵處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，而EF-1α 和Cytb 的表達(dá)比較穩(wěn)定，適合用作內(nèi)參基因。同時(shí)，GeNorm 配對(duì)變異分析結(jié)果表明最佳內(nèi)參基因個(gè)數(shù)為2，且EF-1α 和Cytb 的相關(guān)系數(shù)均較大（分別為0.97 和0.88），適合作為內(nèi)參基因組合對(duì)目的進(jìn)行進(jìn)行校正。因此，本研究建議選擇EF-1α+Cytb 組合進(jìn)行不同F(xiàn)e3+濃度處理下目的基因的校正。

表 4 7 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of the expression stability of seven reference genes

圖 7 不同內(nèi)參基因條件下PEPC1 和PEPC2 基因的相對(duì)表達(dá)量分析Fig. 7 Analysis of relative expression of PEPC1 and PEPC2 genes in different reference genes conditions