同時(shí)測(cè)定黃芩提取液中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素含量的高效液相色譜方法的建立

劉青青 王玉波 劉建偉 徐倩倩 張冉冉 王怡晴

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科；3 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效?，F(xiàn)代研究證明，黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎，提高免疫功能等藥理作用，是日常使用的中藥[1]。黃芩含有黃酮類(lèi)、氨基酸、甾醇類(lèi)、酚酸類(lèi)、糖類(lèi)和微量元素等[2]，其中黃酮類(lèi)中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷是其發(fā)揮作用的主要活性成分[3]。黃芩苷具有清除超氧自由基的作用[4]；黃芩素能夠減輕細(xì)胞膜損傷，改善神經(jīng)細(xì)胞功能[5]；漢黃芩苷在保護(hù)心腦血管方面發(fā)揮著獨(dú)特作用[6]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有黃芩苷的含量測(cè)定，不能全面反映黃芩的質(zhì)量[7]。針對(duì)黃芩及其中藥制劑中黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定的報(bào)道[8-10]比較多，主要涉及藥材指紋圖譜[11]、質(zhì)量評(píng)價(jià)[12]、飲片加工工藝[13]、不同處理方式對(duì)黃芩中黃酮類(lèi)成分含量的影響[14]。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)同時(shí)測(cè)定黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷三種成分，水與不同濃度乙醇提取液中三種成分含量的測(cè)定均未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了同時(shí)測(cè)定中藥黃芩中3種主要成分含量的反相高效液相色譜法，并測(cè)定黃芩水提取液及不同濃度醇提取液中三種主要成分的含量。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括G1379A型在線真空脫氣機(jī)、G1328B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1312A型四元泵、G1314F1260型VWD檢測(cè)器，Agilent Chemstation型色譜工作站(美國(guó)Agilent 科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB型C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國(guó)Agilent 科技有限公司)；BCD-199FD型冰箱(澳柯瑪股份公司)；ALC-210.4型電子天平(廣東中淮檢測(cè)有限公司)；BT型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；SB-3200PT型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；KDW型調(diào)溫電熱套(山東甄城華魯電熱儀器有限公司)；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；501型電熱恒溫干燥箱(龍口先科儀器公司)；SHZ-Ш型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

黃芩(產(chǎn)自山西，批號(hào)為1611101)(山東濱州瑞豐藥店)，參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)黃芩藥材檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)合格，藥材置40 ℃干燥箱干燥12 h后備用。黃芩苷(批號(hào)為21967-41-9)、黃芩素(批號(hào)為491-67-8)、漢黃芩苷(批號(hào)為51059-44-0)(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(化學(xué)純，煙臺(tái)雙雙化工有限公司)；乙腈(色譜純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。水為純化水，LD列管式多效蒸餾水機(jī)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB型C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芩苷0.003 89 g、黃芩素0.006 82 g、漢黃芩苷0.002 45 g，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液各1 mL，置于20 mL容量瓶中，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)定容至刻度，搖勻即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取黃芩約20 g，加10倍量水加熱煮沸，煮沸后改溫火煎煮1 h，4層紗布過(guò)濾，濾渣再加10倍量水煎煮1 h，過(guò)濾，取上清，提取3次，合并三次藥液；濾液于60 ℃減壓濃縮到1 g/mL，黃芩醇提取液采用20%、40%、60%、80%乙醇溶液在水浴鍋中回流提取，提取程序與水煎煮相同。取20%、40%、60%、80%乙醇提取液，水提取液各1 mL分別置于25 mL容量瓶中，用乙腈-0.05%磷酸水溶液(25∶75)定容至刻度，作為供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性考察 取“2.2項(xiàng)下”混合對(duì)照品溶液、水提取液、20%、40%、60%、80%乙醇提取液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷在混合對(duì)照品溶液、水提取液、20%、40%、60%、80%乙醇提取液的保留時(shí)間分別為10、42、22 min。結(jié)果表明，在不同提取液中，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷都具有良好的專(zhuān)屬性，無(wú)雜峰干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1項(xiàng)下”混合對(duì)照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別配制50、100、200、400倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷濃度分別為0.97～19.45，1.71～34.10，0.61～12.25 μg/mL。取1 mL過(guò)0.22 μm濾膜，精密吸取10 μL，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析得：黃芩苷的質(zhì)量濃度在0.97～19.45 μg/mL內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=33 754x-21.284，r=0.999 1；黃芩素在1.71～34.10 μg/mL內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=548 575x-6.555，r=0.999 8；漢黃芩苷在0.61～12.25 μg/mL內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=37 341x-8.710 4，r=0.999 6。配制并進(jìn)樣測(cè)定均重復(fù)5次。

2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品，按“2.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣6次，分別記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.52%、0.84%，0.54%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黃芩60%乙醇提取液6份，按“2.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.94%、0.52%、1.04%，均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黃芩60%乙醇提取液，室溫下靜置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.52%、1.06%、0.86%，均小于2%，表明樣品在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的黃芩提取液1 mL，加入混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.2項(xiàng)制成加標(biāo)供試品溶液，按“2.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷平均回收率分別為98.60%、98.03%和98.54%，計(jì)算RSD分別為1.99%、1.28%和2.01%，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.9 樣品含量測(cè)定結(jié)果 取“2.2.2項(xiàng)下”供試品儲(chǔ)備液，按“2.1項(xiàng)下”色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算不同提取液黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩中三種化合物含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

分別取3種對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋至一定濃度，根據(jù)全波長(zhǎng)掃描黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷，三者分別于275、277、273 nm波長(zhǎng)處獲得最大吸收峰，275 nm處對(duì)黃芩素、漢黃芩苷峰面積未顯示明顯影響，故本次實(shí)驗(yàn)將測(cè)定波長(zhǎng)確定為275 nm。反相色譜常用的洗脫劑有甲醇和乙腈，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了甲醇-0.05%磷酸和乙腈-0.05%磷酸濃度作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇做流動(dòng)相沒(méi)有明顯的峰形，偏離基線，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)沒(méi)有出峰。乙腈-0.05%磷酸洗脫能力更強(qiáng)，能夠呈現(xiàn)更好的峰形，對(duì)稱(chēng)性好，各成分達(dá)到預(yù)期的分離效果。

實(shí)驗(yàn)考察了以水、甲醇、流動(dòng)相分別溶解標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)水溶解對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品色譜峰都有較大影響；甲醇溶解對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰影響不大，而供試品中目的峰出現(xiàn)偏移，色譜峰對(duì)稱(chēng)性不好；流動(dòng)相(乙腈-0.05%磷酸)溶解時(shí)三種成分色譜峰保留時(shí)間短，色譜峰峰形好，但用流動(dòng)相直接溶解標(biāo)準(zhǔn)品，溶液穩(wěn)定性不好，因此標(biāo)準(zhǔn)品選用甲醇溶解制備儲(chǔ)備液，流動(dòng)相(乙腈-0.05%磷酸)作為最終稀釋溶劑。

用20%、40%、60%、80%不同濃度乙醇及純化水提取黃芩，發(fā)現(xiàn)不同提取液中三種成分的含量有顯著差異。崔巍等[14]比較了黃芩50%、75%、95%醇提取液和水提取液中黃芩苷、黃芩素與漢黃芩苷含量，發(fā)現(xiàn)50%醇提取液中黃芩苷、漢黃芩苷兩種成分含量最高，本研究中60%乙醇提取的黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量最高，這與崔巍等研究結(jié)果相似；崔巍等發(fā)現(xiàn)95%醇提液中黃芩素含量最高，而本研究中水提取液中黃芩素含量最高，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

黃芩苷60%醇提取液中含量與謝苗苗等[11]報(bào)道一致，水提、醇提液中黃芩苷含量均低于文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道。黃芩素含量與管仁偉等[12]報(bào)道一致，明顯低于文獻(xiàn)[11,13-14]報(bào)道。漢黃芩苷含量比文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道含量都要低。三種成分含量的差異可能源自藥材質(zhì)量的差異。

綜上所述，本研究建立的測(cè)定黃芩提取液中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷含量的HPLC方法，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，適合同時(shí)測(cè)定黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷的含量，可作為黃芩質(zhì)量控制的參考依據(jù)。60%乙醇提取有利于黃芩苷、漢黃芩苷的溶出，水直接提取有利于黃芩素的溶出。