基于響應(yīng)面法優(yōu)化白鮮皮SFE工藝及抗氧化活性研究*

倪鵬輝，劉春峰，謝 玲，王曉麗，郭麗娜*，王偉明*

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥研究所，黑龍江 哈爾濱150036；2.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾市康盛中藥材飲片加工廠，黑龍江 齊齊哈爾161006；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006）

白鮮皮為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz）的干燥根皮，有羊膻氣。味苦，性寒，歸脾、胃、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，祛風(fēng)解毒之功效，用于濕熱瘡毒，黃水淋漓，濕疹，風(fēng)疹，疥癬瘡癩，風(fēng)濕熱痹，黃疸赤尿等癥。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)白鮮皮含有揮發(fā)油、生物堿類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)和多糖等多種化合物，具有抗腫瘤、止血、抗氧化、抗炎及殺蟲(chóng)等藥理活性。經(jīng)文獻(xiàn)檢索未見(jiàn)采用超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）提取白鮮皮抗氧化活性成分的報(bào)道，因此，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。

響應(yīng)面法（RSM）是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝過(guò)程主要涉及3步：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立數(shù)學(xué)模型評(píng)估相關(guān)性、預(yù)測(cè)響應(yīng)值考察模型的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Spe-ed SFE-2型超臨界流體萃取儀（美國(guó)ASI公司）；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；AE-240型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；FZ102型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；18目型標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

白鮮皮藥材購(gòu)自康盛中藥材飲片加工廠（經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院郭麗娜教授鑒定為白鮮科植物白鮮的根皮）；1.1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH；東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；L（+）-抗血酸（VC天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯、甲醇（AR天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超臨界流體萃取 將白鮮皮藥材粉碎，過(guò)18目篩，稱(chēng)取約15g，裝入萃取釜，將萃取釜連接到超臨界流體萃取裝置，設(shè)置萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行提取。萃取結(jié)束，收集白鮮皮SFE萃取物，計(jì)算得率。計(jì)算公式：提取率%=萃取物量/白鮮皮藥材量×100%。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件 首先，針對(duì)影響超臨界流體萃取較大的影響因素做單因素考察，并確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的水平區(qū)間。利用Design-Expert.V8.0.6軟件根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design,CCD）原理，針對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素，以提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。按照設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到各組實(shí)驗(yàn)條件對(duì)應(yīng)的提取率。利用Design-Expert.V8.0.6軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.3 DPPH法測(cè)定萃取物清除自由基能力 取約100mg超臨界流體提取的白鮮皮萃取物樣品，溶于2mL乙酸乙酯，分別在2mL的DPPH甲醇溶液中加入 0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05mL 的樣品溶液，補(bǔ)加乙酸乙酯至3mL。形成8個(gè)溶度梯度，分別為 6.73、5.89、5.05、4.21、3.37、2.53、1.68、0.84mg·mL-1。空白對(duì)照組加入1mL乙酸乙酯。樣品與DPPH反應(yīng)30min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)517nm處的吸光度值。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按同樣方法測(cè)DPPH自由基清除率。樣品組吸光度值為Ax、空白對(duì)照組吸光度值為A0。自由基清除率計(jì)算公式：清除率%=（A0-Ax）/A0×100%。利用SPSS Statistics軟件進(jìn)行抗氧化活性IC50值計(jì)算。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析。利用SPSS Statistics軟件進(jìn)行抗氧化活性IC50值計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素影響試驗(yàn)

2.1.1 萃取壓力 萃取溫度固定在50℃，萃取時(shí)間固定在30min，考察不同萃取壓力提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，隨著提取壓力的增加，3.00×107Pa壓力前提取率迅速上升，后增加壓力提取率呈緩慢下降趨勢(shì)。為減少能耗，選擇萃取壓力范圍為2.00×107～4.00×107Pa。2.1.2 萃取溫度 萃取壓力固定在3.00×107Pa，萃取時(shí)間固定在30min，考察萃取溫度對(duì)白鮮皮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)白鮮皮萃取物提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the extraction rate of Cortex Dictamni

從圖2可以看出，隨著提取溫度的上升，60℃前提取率迅速上升，后溫度增加提取率不再增加。固選擇萃取溫度范圍為50～70℃。

2.1.3 萃取時(shí)間 萃取壓力固定在3.00×107Pa，萃取溫度固定在60℃，考察萃取時(shí)間對(duì)白鮮皮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)白鮮皮萃取物提取率的影響Fig.3 Influence of extraction time on the extraction rate of Cortex Dictamni

從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，30min前提取率上升，后睡著時(shí)間加長(zhǎng)提取率略有降低。固選擇萃取時(shí)間范圍為20～40min。

2.2 采用RSM優(yōu)化白鮮皮SFE工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平設(shè)計(jì)與方案設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)CCD原理，在上述單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平Tab.1 Factors and levels in the response surface design

利用Design-Expert.V8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，共20個(gè)點(diǎn)，其中14個(gè)為析因點(diǎn)，6個(gè)為零點(diǎn)，以白鮮皮萃取物性成分的提取率為響應(yīng)值（y），設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Response surface designexperiments and results

2.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 利用軟件Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析和顯著性檢驗(yàn)，得到以白鮮皮提取率為目標(biāo)的函數(shù)，關(guān)于各影響因素的二次回歸方程為：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。式中，萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間分別對(duì)應(yīng)A、B、C。方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小直接反應(yīng)了各項(xiàng)萃取因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由回歸方程可知，萃取壓力和萃取溫度的線性項(xiàng)及萃取壓力的二次項(xiàng)對(duì)提取率的影響較為顯著。

對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)值方差分析表Tab.3 Variance analysis of response value

由表3可知，模型p值為0.0003，遠(yuǎn)小于0.01，說(shuō)明該模型極其顯著；其中R2=91.67%，表明91.67%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋?zhuān)f(shuō)明方程的可靠性。模型RSD值顯示實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性，RSD值越低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好，本實(shí)驗(yàn)RSD=8.12%，較低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定性較好。該模型擬合度好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，可以此模型分析預(yù)測(cè)CO2超臨界流體萃取白鮮皮的工藝結(jié)果。由方程各項(xiàng)系數(shù)及表中對(duì)各項(xiàng)系數(shù)的顯著性分析顯示，A、B極顯著，C不顯著；交互項(xiàng)不顯著；二次項(xiàng)A2、B2極顯著，C2不顯著。表明萃取壓力和萃取溫度對(duì)超臨界流體萃取白鮮皮具有很大影響，萃取時(shí)間影響較小。影響程度依次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時(shí)間。

2.2.3 白鮮皮SFE工藝響應(yīng)面分析

圖4～6通過(guò)響應(yīng)面的走勢(shì)及坡度，體現(xiàn)出各實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)響應(yīng)值的影響程度。在這組圖中，萃取壓力和萃取溫度側(cè)曲線變化陡峭，萃取時(shí)間側(cè)相對(duì)平緩，說(shuō)明壓力和溫度較時(shí)間因素對(duì)響應(yīng)值影響明顯。

圖4 萃取壓力和溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Extraction pressure and temperature on the extraction yield

圖5 萃取壓力和時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Extraction pressure and time on the extraction yield

圖6 萃取溫度和時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.6 Extraction temperature and time on the extraction yield

圖4中響應(yīng)面走勢(shì)陡峭，等高線密集，表明萃取壓力和萃取溫度相互作用較顯著。圖5較圖4響應(yīng)面走勢(shì)較平緩，等高線較稀疏，表明萃取壓力和萃取時(shí)間相互作用較弱。圖6響應(yīng)面走勢(shì)平緩、等高線稀疏，表明萃取溫度和萃取時(shí)間相互作用不明顯。

通過(guò)軟件分析得到最佳萃取條件為壓力3.71×107Pa，溫度 67.2222℃，時(shí)間 31.8148min，最大提取率為1.51%，根據(jù)實(shí)際操作修正后得到的最佳條件為 3.71×107Pa，67℃，32min。白鮮皮萃取物提取率理論值可達(dá)到1.51%。為驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化所得結(jié)果，按上述萃取條件平行試驗(yàn)3次，平均提取率為1.50%，與預(yù)測(cè)值相比誤差較小。

2.3 DPPH法[5]測(cè)定白鮮皮萃取物清除自由基活性

表4 不同濃度白鮮皮萃取物及VC與對(duì)應(yīng)DPPH清除率Tab.4 Extraction,VC with different concentrations and Scavenging rate on DPPH

圖7 不同濃度白鮮皮萃取物對(duì)DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of extraction with different concentrations on DPPH

圖8 不同濃度VC對(duì)DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of VC with different concentrations on DPPH

由表4和圖7、8可知，白鮮皮萃取物具有一定的清除DPPH自由基能力，且隨濃度的增加而增強(qiáng)。利用SPSS Statistics軟件計(jì)算得白鮮皮萃取物樣品DPPH 清除率的 IC50=3.79mg·mL-1，VC的 DPPH 清除率的 IC50=0.04mg·mL-1。

3 結(jié)論

（1）采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法得到白鮮皮萃取物CO2超臨界流體提取工藝參數(shù)的二次回歸方程：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。該方程能較好的預(yù)測(cè)超臨界流體萃取白鮮皮的提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

（2）利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并根據(jù)實(shí)際操作修正后得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為：萃取壓力3.71×107Pa，萃取溫度67℃，萃取時(shí)間32min。以此條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到白鮮皮平均提取率為1.50%。

（3）本研究還測(cè)試了用超臨界流體萃取的白鮮皮萃取物清除自由基的能力。白鮮皮萃取物對(duì)DPPH自由基有一定的的清除能力且有濃度依賴(lài)性，IC50=3.79mg·mL-1。與陽(yáng)性對(duì)照品 VC 的 IC50=0.04mg·mL-1相比差很多。