白屈菜炮制方法的初步研究

丁原全，李瑞海，賈天柱

（1.聯(lián)勤保障部隊(duì)大連康復(fù)療養(yǎng)中心 付家莊醫(yī)院，遼寧 大連 116001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

2020版藥典關(guān)于白屈菜的記載，缺少白屈菜的飲片項(xiàng)目，這樣不利于在市場(chǎng)上應(yīng)用白屈菜這味具有良好療效的傳統(tǒng)中藥。本實(shí)驗(yàn)室課題研究?jī)?nèi)容主要是為增加2020版藥典白屈菜飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，白屈菜在臨床中其飲片除了凈制的簡(jiǎn)單方法以外，別無(wú)其他炮制內(nèi)容。但臨床應(yīng)用的過程當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)白屈菜的炮制是有必要的。白屈菜具有止痛的作用，中醫(yī)理論認(rèn)為醋制后能夠引藥歸肝經(jīng)，并增強(qiáng)止痛的作用。同時(shí)，現(xiàn)代研究表明，白屈菜當(dāng)中含有大量的生物堿，那么是不是在經(jīng)過炮制以后，能夠更好的發(fā)揮白屈菜當(dāng)中生物堿類成分的作用，有待于進(jìn)一步的研究。本研究主要的內(nèi)容是利用不同的醋制方法，對(duì)白屈菜炮制條件進(jìn)行初步研究，為白屈菜的飲片進(jìn)一步炮制研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

吉林產(chǎn)白屈菜，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王榮祥教授鑒定為罌粟科植物白屈菜（Chelidonium majus L.）的干燥全草；米醋（廚邦9度米醋，廣東美味調(diào)味食品有限公司）、Chelidonine（YZ180424）（南京源植物生物科技有限公司）、Chelerythrine（20170103）、Berberine（20160907、Sanguinarine（20140717）、）Coptisine hydrochloride（20170719）和 Protopine（201706 12）（由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供）；鹽酸等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)公司）。

1.2 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；安捷倫色譜工作站；SF-130B型高速粉碎機(jī)（上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司）；AS3120型超聲提取器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（CP225D，SARTORIUS）；RE5ZCS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和 Chelerythrine等對(duì)照品加甲醇配制成 0.0160、0.0512、0.0431、0.0218、0.0113和0.0162mg·mL-1的對(duì)照品溶液備用。

1.4 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號(hào)篩）約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加鹽酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液40mL，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20mL，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[2]。

1.5 色譜條件[6]

色譜柱為中匯達(dá)Kromasil分析柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%三乙胺（用H3PO4調(diào)節(jié)pH 值至3.0）-乙腈；梯度洗脫條件，0～18min24%，32min35%檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm；流速為 1mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量為20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)[7]

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL，在上述選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品的分離度良好，且與供試品中的其它成分不干擾。

圖1 對(duì)照品（A）、白屈菜藥材（B）的HPLC圖Fig.1 HPLC of reference（A）and Chelidonium（B）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取 Protopine 0.80mg·mL-1、Chelidonine 1.28mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 1.0775mg·mL-1、Sanguinarine 0.545mg·mL-1、Berberine 0.2825mg·mL-1和 Chelerythrine 0.405mg·mL-1的混合對(duì)照品 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0mL，置于 25mL 量瓶中以甲醇定容，按“1.5項(xiàng)”下的色譜條件，注入液相色譜器儀中，測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 對(duì)照品的進(jìn)樣量和峰面積相關(guān)表Tab.1 Sample quantity and peak area of reference substan ce related list

結(jié)果表明 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對(duì)照品，具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取6種對(duì)照品，測(cè)定，測(cè)得Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和Chelerythrine對(duì)照品的峰面積 RSD（n=6）分別是1.04%、1.02%、1.14%、0.66%、1.20%、0.55%，說(shuō)明方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品，按“1.4項(xiàng)”和“1.5項(xiàng)”下方法制備和HPLC 測(cè)定，結(jié)果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對(duì)照品的峰面積 RSD（n=6）分別為 0.51、4.77、4.71、1.30、0.35 和 1.01mg·g-1，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品，按“1.5 項(xiàng)”下色譜條件，于 0，2，4，8，12，24h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對(duì)照品的峰面積RSD（n=6）分別為1.59%、1.85%、0.63%、1.04%、0.80%、0.92%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取樣品粉末6份，每份2g，精密稱定，置塞錐形瓶中，精密加入 Protopine 1.01mg·mL-1、Chelidonine 9.71mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 9.51mg·mL-1、Sanguinarine 2.58mg·mL-1、Berberine 0.70mg·mL-1和Chelerythrine 2.04mg·mL-1混合對(duì)照品溶液 10mL，按“1.4項(xiàng)”和“1.5項(xiàng)”下方法制備和HPLC測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果 RSD（n=6）分別是 2.43%、2.36%、2.29%、2.30%、2.04%和1.82%，符舍相關(guān)規(guī)定。

2.7 樣品炮制和測(cè)定結(jié)果

2.7.1 分別取白屈菜500g，加入純米醋100g拌勻，分成5份，每份100g，按下述方法處理。炙法，用文火加熱炒干，備用。烘法，烘箱干燥，備用。蒸法，置于蒸籠中加熱蒸20min，取出，將白屈菜用鍋底蒸餾水拌均，烘箱干燥，備用。煮法，將白屈菜置鍋中加入適量清水200g，用文火煮20min，烘箱干燥，備用。燜法，將白屈菜置鍋中，燜20min，取出烘箱干燥，備用。

2.7.2 將生品和醋燜法的白屈菜，各100g，加水沒過藥（200mL），浸泡 20min，先武火后文火，煎煮兩次，合并藥液，濃縮至稠膏，烘至干，各精密稱取0.5g，備用。

2.7.3 取上述樣品，按“1.4項(xiàng)”和“1.5項(xiàng)”下方法制備和HPLC測(cè)定，結(jié)果見表2。

表 2 樣品測(cè)定結(jié)果（mg·g-1，n=3）Tab.2 Samples determination results（mg·g-1）

2.8 小結(jié)與討論

（1）各樣品原阿片堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿和白屈菜紅堿含量測(cè)定結(jié)果見表2，從結(jié)果中看到，燜法相對(duì)于其它的炮制方法，所含總堿量最高。所有的醋制品的6種成分無(wú)論是單一的含量還是總量均低于生品，說(shuō)明炮制過程對(duì)白屈菜的成分是有影響的。說(shuō)明在炮制的過程當(dāng)中，由于條件控制不好，會(huì)使得一些水溶性堿性成分損失，比如在炮制過程中在加醋潤(rùn)濕的過程當(dāng)中，水溶性的生物堿類的成分會(huì)粘在容器的表面而損失掉，這樣的損失由于量是固定的，因此，可以在工業(yè)生產(chǎn)的時(shí)候而相對(duì)減少。其中燜法和烘法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是總成分還是各自的成分來(lái)說(shuō)減少得不多，并都符合藥典的要求。

（2）不容忽視的是湯劑是中藥臨床使用非常廣泛和常見的劑型。因此，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了生品和醋制品湯劑提取效果差別的研究。結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用燜制法進(jìn)行處置的白屈菜在進(jìn)行湯劑煎煮的過程當(dāng)中，其提取率是非常高的，而生品在湯劑煎煮的過程當(dāng)中，提取率則非常低。從這一點(diǎn)可以看出，白屈菜的醋制還是非常必要的。因?yàn)槠浜芏鄩A性成分是原小檗堿類的生物堿為叔胺型以游離的形式存在，是不溶于水的。因此，在經(jīng)過醋制以后，使得其轉(zhuǎn)變?yōu)榧景沸驮黾恿怂苄?，促進(jìn)了其有效成分的溶出。因此，在飲片的過程當(dāng)中，通過本研究結(jié)果表明，白屈菜的飲片炮制過程還是非常有必要的。為初步研究的過程，具體的關(guān)于醋的用量，燜煮時(shí)間等參數(shù)尚需進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

所建立的HPLC含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)單易行，可用于白屈菜樣品的含量測(cè)定，白屈菜燜法炮制方法所得總堿相對(duì)較高，白屈菜的飲片炮制是必要的，但尚需進(jìn)一步的研究，如醋用量、醋的種類、炮制時(shí)長(zhǎng)、溫度等工藝參數(shù)研究，為規(guī)范炮制，其效最大地發(fā)揮，保證白屈菜的臨床用藥療效。