小牛脾提取物注射液對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖及放射敏感性的影響

顧宏韜，趙遠(yuǎn)紅，高國(guó)青，李琪

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 腫瘤科，天津 300120；2.天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，天津 300073）

放射治療是臨床治療肺癌的主要手段之一，因存在較大的個(gè)體差異性，尤其是部分低分化癌對(duì)放射線敏感性較低[1]，需要提高局部放射劑量以期獲得良好的控制率及預(yù)后，可能導(dǎo)致毒副反應(yīng)加重，影響患者生活質(zhì)量。尋找高效低毒的放射治療增敏劑一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。小牛脾提取物注射液（calf spleen extraction injection,CSEI）是提取出生24 h 內(nèi)乳牛脾臟的一類無(wú)菌注射水溶液，主要成分為多肽與核糖[2]。趙巖玲等[3]學(xué)者證實(shí)，CSEI 可以降低晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物水平，提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而延長(zhǎng)患者帶瘤生存期。有學(xué)者提出，CSEI 可以降低乳腺癌、鼻咽癌等放射治療后出現(xiàn)皮膚損傷或口腔黏膜炎癥等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[4]。但其是否對(duì)放射線具有增敏作用，文獻(xiàn)研究報(bào)道較少。多數(shù)放射治療增敏劑的作用機(jī)制為改善腫瘤細(xì)胞乏氧狀態(tài)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等[5]。我國(guó)一直十分重視放射增敏劑的研究，雖然已投入大量時(shí)間和精力，但是研發(fā)成果并不理想，因此尋找新的放射增敏劑對(duì)抗癌治療具有深遠(yuǎn)意義。本文首先從細(xì)胞層面探討CSEI 對(duì)肺癌細(xì)胞放射治療增敏的可能；其次進(jìn)一步從蛋白分子層面分析CSEI 放射治療增敏可能的作用機(jī)制，從而為尋找新的放射治療增敏劑及開發(fā)CSEI 新的臨床應(yīng)用提供一定的理論支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

CSEI（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H22026121，規(guī)格：2 ml/5 mg，多肽∶380μg 核糖），RPMI 1640培養(yǎng)基、D’Hank's 液及胎牛血清（法國(guó)Biowest公司），鏈-青（P/S）雙抗（美國(guó)Gibco公司），MTT（美國(guó)Sigma公司），彗星檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Bcl-2 抗體、Bax 抗體及MDR1（美國(guó)Santa-Cruz公司），Survivin 抗體（美國(guó)Abcam公司），JEM-100CX Ⅱ型透射電鏡（日本電子公司）。FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)體系：10%胎牛血清，100 u/ml P/S雙抗，90% RPMI 1640培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)1×107個(gè)/ml，培養(yǎng)條件：37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組和CSEI組（0.01、0.10、1.00、10.00及100.00 mg/ml）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組：待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組、放射線組（2、4、6、8及10 Gy）及放射線（2、4、6、8及10 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組。彗星實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)分組：待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）及CSEI組（1.0 mg/ml）和放射線組（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不接受任何特殊處理。放射條件：采用醫(yī)用6MeV X 射線，照射劑量為5 Gy，劑量率為200 cGy/min，源靶距為100 cm，照射視野為20 cm×20 cm。

1.3 MTT 法

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞按1×103個(gè)/孔單層接種至96 孔板中，分為空白對(duì)照組、CSEI（0.01、0.10、1.00、10.00及100.00 mg/ml）組，每組設(shè)置8個(gè)平行孔，培養(yǎng)22 ～24 h后，CSEI組細(xì)胞分別接受不同梯度CSEI；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照MTT 法檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density,OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=1-OD 值（受試孔）/ OD 值（對(duì)照孔）×100%；另外采用相同方法檢測(cè)CESI 對(duì)A549細(xì)胞放射線的增敏作用。將接種細(xì)胞分為空白對(duì)照組、放射線組（2、4、6、8及10 Gy）和放射線（2、4、6、8及10 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組，每組設(shè)置8個(gè)平行孔，培養(yǎng)22 ～24 h后，放射線組+ CSEI組細(xì)胞加入1.0 mg/ml CSEI；2 h后，放射線組和放射線+CSEI組細(xì)胞分別接受不同梯度照射劑量，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照MTT 法檢測(cè)OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和增敏比（sensitivity enhancement ratio,SER）。SER=放射線組D0/放射線+CSEI組D0。D0為細(xì)胞增殖活性下降50%時(shí)的放射劑量，即半數(shù)致死 劑量。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞按1×103個(gè)/孔單層接種至6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后分為空白對(duì)照組、放射 線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）和放射線（5 Gy）+ CSEI（1.0 mg/ml）組，處理方式同MTT 法測(cè)定。培養(yǎng)10 ～14 d后，加入4%多聚甲醛固定，吉姆薩染色，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞集落（≥50個(gè)細(xì)胞）形成數(shù)。

1.5 中性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA雙鏈斷裂損傷

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）和放射線組（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組，處理方式同MTT 法。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，采用彗星檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DNA 修復(fù)。用溴化乙啶染色后，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核拖尾情況，并采用CASP軟件進(jìn)行分析。尾距越長(zhǎng)，說(shuō)明DNA雙鏈斷裂情況越嚴(yán)重。雙鏈斷裂程度（%）=受試組彗星拖尾長(zhǎng)度/ 空白對(duì)照組彗星拖尾長(zhǎng)度×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI（1.0 mg/ml）組和放射線組（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組，處理方式同MTT法。每組分別收集2 管細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 107個(gè)/ml，第1 管加入20μl RNase A 溶液，37℃水浴30 min，加入400μl PI 染色，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；第2 管加入500μl Binding Buffer、5μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育4 h，上機(jī)前20 min 加入5μl PI，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blotting 檢測(cè)相關(guān)蛋白

收集空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）和放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組，加入PMSF細(xì)胞裂解液，提取蛋白。采用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。加熱煮沸，使蛋白變性，10% SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶密閉，分別加入Bcl-2 抗體（1 ∶500 稀釋）、Bax 抗體（1 ∶500稀釋）、Survivin 抗體（1 ∶1 000 稀釋）及MDR1 抗體（1 ∶1 000 稀釋），置于4℃搖床上過(guò)夜。采用TBST 反復(fù)沖洗，加入二抗（1 ∶5 000 稀釋）。ECL試劑顯影，拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graph Pad Prism7.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用

MTT 法檢測(cè)顯示，不同濃度CSEI（0.01、0.10、1.00、10.00及100.00 mg/ml）處理后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，分別為（0.56±0.43）%、（0.88±0.74）%、（1.25±0.85）%、（23.42±4.75）%及（44.89±9.82）%。0.01、0.10及1.00 mg/ml CSEI 對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用基本一致，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.967，P=0.165）。1.00、10.00及100.00 mg/ml CSEI 對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=95.455，P=0.000），且進(jìn)一步兩兩比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。1.0 mg/ml是CESI 無(wú)毒的最高劑量。見圖1。

圖1 CESI 對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

2.2 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞照射后增殖活性的影響

MTT 法檢測(cè)顯示，不同放射劑量（2、4、6、8及10 Gy）照射后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，D0為5.997 Gy。而不同放射組細(xì)胞給予CSEI（1.0 mg/ml）預(yù)處理后，各組細(xì)胞增殖抑制率比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，處理因素CSEI的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.124，P=0.000）；處理因素放射線的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=89.675，P=0.000）。兩者交互作用比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.145，P=0.196）。因而無(wú)論是否進(jìn)行CSEI處理，經(jīng)不同放射劑量（2、4、6、8及10 Gy）照射后，細(xì)胞增殖活性均受到抑制；而給予CSEI（1.0 mg/ml）預(yù)處理后，能夠增強(qiáng)放射線對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的抑制作用。放射線組D0為5.997 Gy，放射線+CSEI（1.0 mg/ml）組D0為4.216 Gy。SER 為（1.42±0.06）。見表1和圖2。

表1 兩組A549細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后增殖抑制率的變化（±s）

表1 兩組A549細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后增殖抑制率的變化（±s）

組別 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy 10 Gy放射線組 11.43±2.57 16.38±3.79 50.74±5.93 69.35±6.47 73.62±6.58放射線+CSEI（1.0 mg/ml）組 24.85±3.16 43.24±4.41 69.53±6.28 82.92±7.63 86.45±7.98

圖2 兩組A549細(xì)胞增殖率的變化趨勢(shì)（±s）

2.3 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞照射后集落形成的影響

平板克隆試驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）及放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞集落形成率分別為（48.88±8.37）%、（26.63±5.46）%、（30.50±7.12）%及（12.38±2.64）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.897，P=0.000），放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞集落形成率低于空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）及CSEI組（1.0 mg/ml）（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 各組A549細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞集落

圖4 各組A549細(xì)胞集落形成率比較（±s）

2.4 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞照射后DNA雙鏈斷裂損傷的影響

中性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）及放射線（5 Gy）+ CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞核拖尾細(xì)胞數(shù)、尾長(zhǎng)及尾距，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞核拖尾細(xì)胞數(shù)、尾長(zhǎng)、尾距多于其他組（P＜0.05）。見表2和圖5。

2.5 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞照射后凋亡活性的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）、放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞凋亡率分別為（4.85±1.32）%、（38.76±6.53）%、（28.70±5.43）%、（56.74±8.79）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=99.198，P=0.000）；放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞凋亡率高于其他組（P＜0.05）。見圖6、7。

表2 各組A549細(xì)胞的拖尾細(xì)胞數(shù)、尾長(zhǎng)、尾距比較（n =200，±s）

表2 各組A549細(xì)胞的拖尾細(xì)胞數(shù)、尾長(zhǎng)、尾距比較（n =200，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與放射線組（5 Gy）比較，P ＜0.05；③與CSEI（1.0 mg/ml）組比較，P ＜0.05。

組別 拖尾細(xì)胞數(shù) 尾長(zhǎng)/μm 尾距/μm空白對(duì)照組 23.38±4.12 30.25±2.77 3.41±0.68放射線組（5 Gy）67.75±12.31 45.73±4.26 6.62±0.95 CSEI組（1.0 mg/ml）44.50±9.87 38.97±4.10 5.57±0.82放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組 120.63±27.65①②③ 72.58±4.73①②③ 26.34±1.76①②③F 值 54.359 164.159 715.423 P 值 0.000 0.000 0.000

圖5 各組A549細(xì)胞的彗星圖像（×400）

圖6 CSEI和放射線對(duì)A549細(xì)胞凋亡活性的影響

2.6 CSEI 對(duì)A549細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）及 放 射 線（5 Gy）+ CSEI（1.0 mg/ml）組G1期、G2/M期和S期 細(xì) 胞比例比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，放射線（5 Gy）+ CSEI（1.0 mg/ml）組G1期 細(xì) 胞和S期 細(xì) 胞 減 少（P＜0.05）；而G2/M期 細(xì) 胞 增 多（P＜0.05）。見表3。

2.7 CSEI和放射線對(duì)A549細(xì)胞Bcl-2、Bax、Survivin及MDR1 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）及放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組 細(xì) 胞Bcl-2、Bax及Survivin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞Bcl-2和Survivin 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于其他組（P＜0.05）；而Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于其他組（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組、放射線組（5 Gy）、CSEI組（1.0 mg/ml）及放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞MDR1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖8。

圖7 各組A549細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表3 CESI和放射線對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（±s）

表3 CESI和放射線對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與放射線組（5 Gy）比較，P ＜0.05；③與CSEI組（1.0 mg/ml）比較，P ＜0.05。

組別 G1期 G2/M期 S期空白對(duì)照組 74.83±2.92 18.46±1.27 7.65±1.33放射線組（5 Gy）63.51±2.75 24.67±1.78 5.08±1.56 CSEI組（1.0 mg/ml）79.16±2.93 16.53±1.96 3.82±1.25放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組 65.49±3.16①②③32.69±1.84①②③1.84±0.59①②③F 值 53.168 141.286 30.987 P 值 0.000 0.000 0.000

表4 各組A549細(xì)胞Bcl-2、Bax 、Survivin及MDR1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組A549細(xì)胞Bcl-2、Bax 、Survivin及MDR1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與放射線組（5 Gy）比較，P ＜0.05；③與CSEI組（1.0 mg/ml）比較，P ＜0.05。

組別 Bcl-2 Bax Survivin MDR1空白對(duì)照組 1.35±0.26 0.36±0.10 0.94±0.23 0.86±0.17放射線組（5 Gy）0.78±0.15 0.47±0.12 0.59±0.16 0.94±0.25 CSEI組（1.0 mg/ml）0.69±0.20 0.65±0.17 0.60±0.18 0.94±0.24放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組 0.42±0.13①②③ 0.84±0.20①②③ 0.32±0.11①②③ 0.98±0.21 F 值 33.308 15.211 16.783 0.420 P 值 0.000 0.000 0.000 0.740

圖8 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Survivin及MDR1 蛋白的表達(dá)（±s）

3 討論

放射治療是肺癌最常用的治療手段之一，基本原理是通過(guò)電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA 損傷，從而促進(jìn)凋亡。多年臨床實(shí)踐證實(shí)，不同患者放射敏感性和耐受性差異較大，是影響患者預(yù)后，導(dǎo)致治療失敗的主要原因[6]。有學(xué)者提出放射治療增敏劑的概念，主要為硝基咪唑類化合物及其衍生物[7]。但是由于化學(xué)合成制劑本身具有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，從而限制其在臨床的大力推廣。CSEI在臨床主要用于提高機(jī)體免疫力，同時(shí)可作為放射不良反應(yīng)的輔助治療用藥。但是尚未有研究分析CSEI 可作為放射治療增敏劑的可能。

理想的放射治療增敏劑應(yīng)該具有性質(zhì)穩(wěn)定、細(xì)胞毒性低、增敏作用可逆轉(zhuǎn)等特點(diǎn)[8]。本研究中，首先通過(guò)MTT 法確定CSEI 最高無(wú)毒劑量為1.0 mg/ml。因此，筆者在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中初步選定1.0 mg/ml 作為CSEI的用藥劑量。進(jìn)一步采用MTT 法，在放射線照射前2 h 先給予1.0 mg/ml CSEI 預(yù)處理，證實(shí)1.0 mg/ml CSEI可增加不同照射劑量對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用，輻射增敏比為（1.42±0.06）；另外，放射線（5 Gy）+ CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞集落形成率低于空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）及CSEI組（1.0 mg/ml），從而推斷1.0 mg/ml CSEI 對(duì)A549細(xì)胞具有放射增敏作用。

目前，關(guān)于放射增敏劑作用機(jī)制的研究主要集中在影響細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、靶向提高信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的敏感性及增加放射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性損傷等方面[9]。錢鵬飛等[10]學(xué)者通過(guò)臨床研究證實(shí)，小牛脾提取物可提高晚期乳腺癌患者化學(xué)治療的療效，改善生活質(zhì)量，減輕化學(xué)治療相關(guān)的骨髓抑制毒副反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對(duì)晚期腫瘤患者臨床化學(xué)治療有積極地推進(jìn)作用。程惠華等[11]學(xué)者也證實(shí)，CSEI 對(duì)接受同步放射治療、化學(xué)治療的宮頸癌患者在保護(hù)骨髓和提高生活質(zhì)量等方面具有很好的作用。但是目前關(guān)于CSEI對(duì)放射治療的增敏作用研究尚少。本研究中，關(guān)于CSEI 放射增敏機(jī)制的研究，首先通過(guò)中性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞核拖尾細(xì)胞數(shù)、尾長(zhǎng)及尾距較空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）及CSEI組（1.0 mg/ml）增加，說(shuō)明1.0 mg/ml CSEI 增加A549細(xì)胞對(duì)放射線敏感性的機(jī)制可能與增加放射線誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA 損傷有關(guān)。其次，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組、放射線組（5 Gy）或CSEI組（1.0 mg/ml），從而推斷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡可能也是CSEI 放射治療的增敏作用機(jī)制之一。另外有研究顯示，處于不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性不同，放射線主要是將細(xì)胞周期阻滯于M期和G1 末期，而對(duì)G0期細(xì)胞影響較小[12]。但是在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)CSEI組（1.0 mg/ml）G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞數(shù)減少，說(shuō)明CSEI 可特異性阻礙腫瘤細(xì)胞由G1/G0期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，而且放射線（5 Gy）+CSEI（1.0 mg/ml）組G1期細(xì)胞和S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增多，說(shuō)明CSEI 可能與放射治療產(chǎn)生協(xié)同作用，阻止腫瘤細(xì)胞向DNA 合成期（S期）轉(zhuǎn)化，從而提高放射治療的療效。

筆者還進(jìn)一步從蛋白分子水平分析CSEI 對(duì)A549細(xì)胞放射治療增敏作用的主要機(jī)制。Bcl-2 家族蛋白和Survivin都屬于重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2屬于抗凋亡因子，主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放來(lái)促進(jìn)Bax或抑制Bcl-2 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。當(dāng)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)時(shí)，Bcl-2與Bax 形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[14]。而Survivin 也屬于凋亡抑制蛋白[15]，在多數(shù)肺癌組織中呈高表達(dá)，是目前腫瘤治療最重要的分子靶標(biāo)之一[16]。余江濤等[17]學(xué)者證實(shí)，Survivin和Bcl-2 蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。沉默Survivin基因表達(dá)后，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)。本研究中，CSEI與放射線聯(lián)合作用，可抑制Bcl-2和Survivin 蛋白表達(dá)；同時(shí)上調(diào)Bax 蛋白表達(dá)水平。黎喜梅等[18]學(xué)者證實(shí)，放射治療可誘導(dǎo)腫瘤組織中MDR1 蛋白表達(dá)上調(diào)，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。本研究中，通過(guò)Western blotting 并未發(fā)現(xiàn)CSEI 對(duì)MDR1 蛋白表達(dá)的影響，但是并不能說(shuō)明MDR1 蛋白分子未參與CSEI和放射線對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

綜上所述，1.0 mg/ml CSEI 可增加人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 對(duì)放射線的敏感性，其作用機(jī)制可能與影響腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞核DNA雙鏈損傷等有關(guān)。從而為CSEI 用于放射治療增敏提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是是否可以作為放射治療增敏劑用于臨床，尚需要更全面、更系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。