鄭州市134例結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌分離株的耐藥特點分析

曹小九，李洪智，張曉琦

結(jié)核病是因機體感染結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)所致，傳染性強，潛伏期4～8周，可導(dǎo)致人體多個臟器受累，如腎臟、肺部、腦部等，以肺結(jié)核最為常見，傳播途徑包括母嬰傳播、飲食傳播、空氣傳播等[1]。目前，臨床上結(jié)核疾病以藥物治療為主，常用抗結(jié)核藥物有乙胺丁醇、異煙肼、鏈霉素、利福平等，但患者多存在耐藥，耐多藥菌已成為抗結(jié)核效果欠佳的重要原因[2]。據(jù)報道[3]，某城市新發(fā)結(jié)核病患者耐多藥率為4.8%～8.7%，復(fù)發(fā)結(jié)核病患者耐多藥率達(dá)25.6%～26.3%，治療較困難。耐藥菌播散會造成患者個人及其家庭、社會成員感染，若未能及時遏制，則會導(dǎo)致更多人遭受耐藥MTB侵襲，引起新傳染源，增加治療難度[4]。為了解本市結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株對抗結(jié)核藥的耐藥特點，本研究分析了134例結(jié)核病患者的耐藥特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2020年3月—2022年3月收治的鄭州市結(jié)核病患者134例進(jìn)行回顧性分析，其中初治患者75例，復(fù)治患者59例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合結(jié)核病相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；經(jīng)痰液MTB培養(yǎng)提示存在致病菌生長；年齡≥15歲；資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：重要臟器出現(xiàn)器質(zhì)性病變；凝血功能異常；患免疫性疾病、腫瘤疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癲癇等；患其他類型的感染性疾病。

1.2 主要設(shè)備和試劑 主要儀器為L535R型高速離心機(湖南湘儀集團(tuán))、DW-86L34B型低溫保存箱(澳柯瑪股份有限公司)、XK96-A振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)。主要試劑為硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid,PNB)、分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)基，均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集所有受試者晨痰4 mL，置于無菌培養(yǎng)盒中，制備3張?zhí)低科?，行瑞?姬姆薩染色，觀察細(xì)胞計數(shù)及分類情況。經(jīng)低倍鏡觀察，若鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)目<10個，且白細(xì)胞數(shù)目>25個，則提示樣本滿足檢測要求。

1.3.2 MTB培養(yǎng) 將4 mL痰液標(biāo)本置于離心管內(nèi)，加入4倍量2%氫氧化鈉溶液，經(jīng)振蕩器振蕩10～20 s，使樣本液化。室溫下靜置15 min，加入45 mL磷酸鹽緩沖液，擰緊螺旋蓋。在8 ℃下行離心處理，時間20 min(3 000×g)，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液1 mL，充分混合。將處理后的樣本接種于培養(yǎng)基，每支0.4 mL，標(biāo)記接種日期及編號，37 ℃水平孵育48 h，然后調(diào)整為直立培養(yǎng)，擰緊蓋子。接種3～7 d后，觀察有無菌落生長，之后每間隔1周觀察1次，了解有無菌落生長。若存在菌落生長，且行抗酸染色證實為分枝桿菌，則提示分枝桿菌陽性，若觀察8周后，仍無分枝桿菌生長，則提示陰性。

1.3.3 MTB鑒定 分別制備PNB與TCH培養(yǎng)基。PNB培養(yǎng)基：取PNB溶液加至羅氏培養(yǎng)基，使最終濃度為0.5 mg/mL，平分裝于培養(yǎng)管，經(jīng)凝固器凝固(85 ℃)，滅菌處理50 min，存至4 ℃環(huán)境備用。TCH培養(yǎng)基：經(jīng)10 mL滅菌水稀釋TCH溶液(5 mg)，取稀釋后溶液1 mL加入羅氏培養(yǎng)基，使最終濃度為5 μg/mL，平分裝于培養(yǎng)管，滅菌處理50 min，存至4 ℃環(huán)境備用。若TCH、PNB均不生長，則提示為牛分枝桿菌，若TCH生長，PNB不生長，則提示MTB，若兩者均生長，則提示非MTB。

1.3.4 藥敏試驗 利用比例法進(jìn)行藥敏試驗。首先準(zhǔn)備含藥培養(yǎng)基，本次分析的抗結(jié)核藥物包括一線藥物如異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素及利福平，二線藥物如左氧氟沙星、卡那霉素、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺、阿米卡星及卷曲霉素，藥物最終濃度依次如下：0.2、2.0、4.0、40.0、2.0、30.0、1.0、40.0、1.0、40.0 μg/mL。無菌分裝于試管，5毫升/管，在85 ℃下凝固50 min，于4 ℃下存儲備用。選取4周左右菌齡的菌株行藥敏試驗，低溫環(huán)境取出培養(yǎng)基，平衡至室溫，標(biāo)記受試者的姓名、編號、日期等信息。取2滴10% Tween80加入磨菌瓶，并加入細(xì)菌，對接種環(huán)行加熱滅菌處理。將磨菌瓶封蓋，振蕩30 s，加生理鹽水混勻。將菌液吸入無菌試管，加生理鹽水，使菌液濃度為1 mg/mL。用接種環(huán)取2環(huán)菌液，加入滅菌生理鹽水(2 mL)中，予以100倍稀釋，取稀釋后菌液2環(huán)，加入滅菌生理鹽水(2 mL)內(nèi)，予以10 000稀釋。分別取1環(huán)10-4菌液，接種于含藥培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基，分別取1環(huán)10-2菌液，接種于含藥培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基。封蓋，豎直在37 ℃下培養(yǎng)，待4周可出報告結(jié)果。報告標(biāo)準(zhǔn)[6]如下：(1)陰性：無菌落生長；(2)實際菌落數(shù)：菌落<50個；(3)1+：菌落為50～100個；(4)2+：菌落為101～200個；(5)3+：菌落為201～500個；(6)4+：菌落>500個。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基菌落數(shù))×100%，若該百分比≥1%，則提示耐藥，否則提示敏感。

1.4 耐藥定義分析 方法如下[7]：(1)單耐藥：僅對一種一線藥物耐藥；(2)多耐藥：對≥2種(及以上一線)藥物耐藥(不含對異煙肼、利福平同時耐藥)；(3)耐多藥：至少對利福平、異煙肼同時耐藥；(4)廣泛耐藥：在耐多藥基礎(chǔ)上，至少對一種二線藥物或氟喹諾酮類藥物耐藥。

1.5 質(zhì)量控制 藥敏試驗和痰培養(yǎng)方法均符合相關(guān)實驗室操作規(guī)程，操作時嚴(yán)格根據(jù)說明書進(jìn)行，遵循無菌原則。藥敏試驗質(zhì)控以H37RV為標(biāo)準(zhǔn)對照，確保質(zhì)量。同組檢測人員對菌株及耐藥情況檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用n，%表示，率的比較行χ2檢驗或校正χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核病患者M(jìn)TB耐藥情況分析 134例患者共分離出MTB 134株，54(40.30%)株為耐藥菌，其中單耐藥11(20.37%)株，多耐藥15(27.78%)株，耐多藥14(25.93%)株，廣泛耐藥14(25.93%)株。不同性別、年齡的患者間耐藥情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)治者耐藥率高于初治者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株耐藥類型比較 2種類型患者M(jìn)TB單耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)治患者多耐藥率、耐多藥率及廣泛耐藥率均高于初治患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 結(jié)核病患者M(jìn)TB耐藥情況分析

表2 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株耐藥類型比較

2.3 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株耐藥組合特點比較 初治患者和復(fù)治患者的藥物組合耐藥情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株耐藥組合特點比較

2.4 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株任意耐藥分布特點比較 復(fù)治患者異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素及利福平耐藥率均明顯高于初治患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同類型結(jié)核病患者M(jìn)TB分離株任意耐藥分布特點比較

3 討論

我國結(jié)核病新發(fā)病例占全球的15%，患者帶菌時間長，主要通過呼吸道傳播，治療周期長[8]。現(xiàn)階段以抗結(jié)核藥物治療為主，雖取得一定效果，但隨著用藥時間延長，容易產(chǎn)生耐藥性，若早期耐藥未能獲得有效、及時的控制，可進(jìn)展為廣泛性耐藥，進(jìn)一步加大治療難度[9]。合理控制耐藥率，尋找新的治療方案，仍是臨床關(guān)注的重點。我國結(jié)核病完全治愈率并不理想，做好結(jié)核病防控和耐藥預(yù)防顯得格外重要[10]。目前，本市結(jié)核病耐藥情況尚未完全明確，分析本市結(jié)核病耐藥特征可為該病干預(yù)提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，134例結(jié)核病患者共檢出134株MTB，其中對抗結(jié)核藥耐藥的比例高達(dá)40.30%。李曉曉等[11]分析422例結(jié)核病患者耐藥特點，發(fā)現(xiàn)耐藥率為38.6%，與本次結(jié)果接近。國外有研究[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者的耐多藥和廣泛耐藥率較高，認(rèn)為主要與MTB生長緩慢和治療周期長有關(guān)。本研究復(fù)治患者的耐藥率高于初治患者，尤其多耐藥率、耐多藥率、廣泛耐藥率明顯。分析原因可能與復(fù)治患者接受治療次數(shù)更多，治療周期更長有關(guān)，導(dǎo)致耐藥的風(fēng)險增加。部分初治患者經(jīng)過短期治療后病情好轉(zhuǎn)，自行停藥不久后復(fù)發(fā)，這類患者往往依從性欠佳[13]。部分患者因不能耐受抗結(jié)核藥物引起不良反應(yīng)，導(dǎo)致中途停藥，出現(xiàn)用藥不規(guī)律或不規(guī)范現(xiàn)象[14]。左延才等[15]分析了888例結(jié)核病患者，發(fā)現(xiàn)復(fù)治患者的耐藥率高達(dá)38.60%，明顯高于初治患者的15.65%，同樣顯示復(fù)治患者耐藥率高。本研究復(fù)治患者耐藥率達(dá)66.10%，高于繼往研究結(jié)果，可能與樣本量、治療周期不同有關(guān)。

抗結(jié)核藥物治療既有單一用藥，也有采用聯(lián)合用藥方案。本研究結(jié)果顯示，初治、復(fù)治患者不同藥物組合方案耐藥率未見差異。初治患者一線抗結(jié)核藥物(包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、利福平)的任意耐藥率低于復(fù)治患者。一線藥物為治療結(jié)核病的首選藥物，療效多可靠，但隨著病程和用藥周期的延長，易產(chǎn)生耐藥性，尤其是復(fù)治病例。解冰潔等[16]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者不僅對一線藥物耐藥率高，而且對二線藥物卡那霉素、氧氟沙星的耐藥率也較高。而本研究中初治、復(fù)治患者對二線藥物的任意耐藥率均較低，與上述研究結(jié)論不同。這可能與用藥特點不同有關(guān)，本市一線藥物使用頻率高，二線藥物頻率相對較低，故二線藥物耐藥風(fēng)險更低。

綜上所述，本市結(jié)核病患者對一線抗結(jié)核藥物總體耐藥率高，特別是復(fù)治患者的多耐藥率、耐多藥率、廣泛耐藥率，任意藥物耐藥中主要對一線藥物耐藥。因此，本市需加強抗結(jié)核藥物的用藥管理，采取耐藥率控制措施，以降低結(jié)核桿菌耐藥風(fēng)險。