分子印跡光子晶體陣列傳感器的構建及其對雙酚A和雙氰胺的檢測

張 鑫 李彥松 韓 睿 蔣艷艷 劉哲涵

1(南陽師范學院，生命與科學技術學院，南陽473061)2(北京理工大學，生命學院，北京100081)

1 引 言

雙酚A(Bisphonel A，BPA)作為一種化工原料，廣泛用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的制造生產(chǎn)，也常用于食品、飲料、塑料奶瓶等生活消費品的包裝內襯[1,2]。研究表明，BPA是一種環(huán)境雌激素，食品、飲料容器中的微量BPA會通過降解擴散至水及土壤中，通過生物富集到人體中，導致內分泌失調，誘發(fā)疾病以及新陳代謝紊亂，給人體健康帶來極大危害[3～5]。目前，用于檢測微量BPA殘留的方法主要有電化學法[6]、高效液相色譜法[7]、生化傳感器[8]、液相色譜-質譜聯(lián)用技術[9]等。這些方法成本較高、檢測過程需要經(jīng)過采樣、預處理、提取、衍生化、純化等過程，需要復雜而精密的設備和專業(yè)培訓的操作人員，耗時耗力，不便于野外考察以及現(xiàn)場快速檢測。雙氰胺(Dicyandiamide，DCD)是一種有機化工原料，在農業(yè)生產(chǎn)中常作為硝化抑制劑添加到復合肥中，防止土地中的氮流失，促進牧草生長[10]。然而，水土中的DCD會殘留在牧草中，奶牛食用后會導致乳制品中微量的DCD殘留，對嬰幼兒的健康有著潛在的危害[11]。DCD分析技術需要復雜的樣品前處理過程和精密儀器，檢測成本高，操作復雜，不便于操作和推廣使用[12～14]。因此，有必要開發(fā)出操作簡單、攜帶方便、能快速準確地測定BPA以及DCD的檢測方法。

光子晶體(Photonic crystals，PCs)是一種可以由人工設計和制備的，在光學尺度上具有周期性介電結構的晶體材料[15～17]。分子印跡技術(Molecular imprinting technique，MIT)是一種模擬抗原和抗體的特異性結合，人工構建與目標物在大小、形狀、功能基團互補結合的聚合物技術[18]。采用對應的洗脫體系對聚合物上的模板分子的洗脫，可得到與模板分子互補匹配的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer, MIP)。在適合的條件下，此印跡空穴可選擇性捕獲模板分子，實現(xiàn)目標物的特異識別和分離檢測。因此，將光子晶體與分子印跡聚合物結合，可以構建出同時兼具分子印跡聚合物和光子晶體的優(yōu)點的分子印跡反蛋白石光子晶體聚合物(Molecularly imprinted inverse-opal photonic crystal polymers，MIPPs)。基于分子印跡作用，MIPPs可以特異結合模板分子，引起MIPPs上的空穴結構改變，使其衍射峰發(fā)生位移甚至結構色產(chǎn)生明顯的變化。因此，這種材料可以作為傳感元件，用于特定物質的光學分析檢測，具有操作簡單、響應快速、靈敏性和選擇性高等優(yōu)點[19～22]。

目前，已有很多關于 MIPPs應用的報道[23～27]，但對BPA和DCD的檢測研究不多且集中在單一物質檢測[28～30]，而利用MIPPs作為傳感元件同時對實際樣品中兩種物質傳感分析的應用更少。本研究設計開發(fā)了基于BPA、DCD的 MIPPs的陣列傳感器，以期建立一種快速準確、操作簡單、成本低廉的檢測方法，用于環(huán)境水樣、食品中微量BPA和DCD的快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SB-5200DTD超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Specord高精密紫外-可見分光光度計(德國耶拿公司)；中興101恒溫鼓風干燥器(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Sigma 500/VP場發(fā)射掃描電鏡(德國卡爾蔡司公司)；NovaNano 430掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。

DCD、丙烯酰胺購自國藥集團化學試劑有限公司；BPA、偶氮二異丁氰(AIBN)、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購自上海阿拉丁生物化學技術有限公司；無水甲醇、無水乙醇、乙腈、濃H2SO4、H2O2(30%)、HF(≥40%)等試劑購自北京化工廠。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 膜基質的準備將清洗后的玻片裁為 75 mm×10 mm大小，置于Piranha溶液(98% H2SO4-30% H2O2，7∶3，V/V)中浸泡 12 h，用水洗滌干凈后用氮氣吹干。另將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)裁剪為厚度1 mm、尺寸為75 mm×8 mm的薄片，備用。

2.2.2 光子晶體模板的制備采用垂直沉降的膠體自組裝法制備光子晶體模板[31]。首先，將粒徑220～260 nm的SiO2在無水乙醇中超聲分散；然后，加入10 mL離心管中，用無水乙醇稀釋(其中SiO2質量濃度為2.5%)；最后，將玻片基質以45℃傾斜插入管中，將離心管放到組裝板上，密閉空間下恒溫30℃靜置5～7天左右，待乙醇揮發(fā)完畢后，即制得蛋白石結構的光子晶體模板。

2.2.3 MIPPs的構建分別制備BPA和DCD MIPPs的預聚合溶液。選用BPA與DCD為模板分子，致孔劑為乙醇-水(3∶2，V/V)，功能單體為MAA，交聯(lián)劑為EGDMA，引發(fā)劑為AIBN。

采用后填充技術[32]構建MIPPs。 具體過程如下：首先，將按上述比例配制的預聚合溶液在毛細管作用的推動下緩慢注入SiO2顆粒組裝的光子晶體模板內，然后 PMMA或PET膜覆蓋在光子晶體模板表面，并給予一定壓力，保證膜的成型以及減少聚合溶液蒸發(fā)面積；其次，將覆蓋完成的玻片迅速轉移到密閉容器中，通入氮氣除去氧氣，然后在密閉容器中，用紫外光引發(fā)聚合反應3 h；將膜片取出，此時已制備成功與硅膠光子晶體模板具有互補結構的反蛋白石MIPPs聚合膜；最后，將得到的膜片分子印跡聚合物膜浸入5% (V/V)HF中緩慢攪拌過夜，直至完全刻蝕除去膜上的SiO2微粒，用電鏡觀察。將得到的光子晶體印跡膜用甲醇-乙酸(9∶1，V/V)混合溶液反復洗脫3次，每次1 h，除去模板分子。作為對照，非印跡光子晶體聚合物膜(Non-imprinted photonic crystal polymers, NIPPs)除不加入模板分子外，其余操作過程均與分子印跡聚合物膜相同。

2.2.4 制備條件優(yōu)化考察了不同單體使用量對成膜效果和性能的影響。分別加入不同摩爾比的模板分子與功能單體(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，n/n)，混勻后超聲分散10 min，然后加入交聯(lián)劑EGDMA(150 μL)超聲5 min，加入引發(fā)劑((NH4)2SO4， 10 mg)，紫外光引發(fā)聚合反應3 h，并考察制備的光子晶體分子印跡膜衍射峰位移的變化。選擇甲醇-乙酸(9∶1，V/V)、甲醇-水-乙酸(7∶2∶1，V/V)、0.1 mol/L乙酸溶液分別作為模板分子的洗脫體系，考察不同洗脫體系對模板分子的洗脫效果。

2.2.5 吸附性能測定分別將制備的BPA及DCD MIPPs與NIPPs置于不同濃度的目標物標準品溶液中，考察其吸附動力學，記錄最大衍射峰位移隨時間的變化曲線。

配制一系列濃度的DCD與BPA標準品溶液，將BPA及DCD MIPPs與NIPPs分別置于樣品溶液中孵育，考察吸附行為。采用Specord高精密紫外-可見分光光度計掃描其最大衍射峰，并計算在不同濃度目標物溶液中MIPPs與NIPPs的最大衍射峰位移量變化值。

2.2.6 環(huán)境水樣分析環(huán)境水樣取自草地邊的河水和湖水，樣品經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后,在4℃保存，備用。檢測時，將制備的MIPPs陣列傳感器分別置入不同樣品中，記錄不同MIPPs傳感單元上的衍射峰位移變化。

3 結果與討論

3.1 MIPPs的制備

在獲得光子晶體模板之后，將分子印跡預聚合溶液注入光子晶體模板與PMMA之間的縫隙，直至預聚合溶液充滿SiO2微球之間的縫隙。功能單體與模板分子(BPA、DCD)通過非共價作用(氫鍵、范德華力)結合，然后在交聯(lián)劑作用下，在光子晶體模板上交聯(lián)成反蛋白石結構的網(wǎng)狀聚合物，最后在不同的洗脫體系下洗脫去除模板分子，制備得到對應模板分子的MIPPs。制備的MIPPs可以特異地吸附結合模板分子，導致聚合物空穴結構發(fā)生變化，從而產(chǎn)生衍射峰位移，甚至結構顏色的變化。

分別對單體用量、洗脫條件進行了考察。在BPA與DCD用量一定的條件下，當單體用量較少時，構成的聚合物膜結構不穩(wěn)定，缺乏剛性；而單體用量越高，制備的聚合物膜結構致密，穩(wěn)定性好，并且制備的MIPPs在置入BPA樣品溶液中衍射峰位移明顯。但是過高的單體用量會導致構成的MIPPs易黏連在基質玻片的表面，較脆, 易損壞。綜合考慮，選擇BPA聚合體系中單體用量與模板分子最佳摩爾比為1∶2，DCD聚合體系中單體用量與模板分子的最佳摩爾比為1∶4。此外，不同的體系洗脫，對MIPPs與模板分子的特異結合能力有明顯的影響。采用0.1 mol/L乙酸時，對DCD的洗脫效果最好；而采用甲醇-水(9∶1，V/V)混合溶液時，對BPA的洗脫效果最好。

3.2 形貌表征

采用掃描電子顯微鏡分別對制備的光子晶體模板和MIPPs的形態(tài)進行了分析，結果如圖1所示。由圖1A可知，制備的光子晶體由SiO2微球周期性有序排列而成，呈蛋白石結構，結構均一，排列致密有序。由圖1B可見，制備的光子晶體模板由多層SiO2組成，每層微球與微球之間形成有序多孔結構，為分子印跡聚合物的制備提供了充足條件。由圖1C可知，制備的MIPPs具有明顯反蛋白石多孔結構，經(jīng)過刻蝕SiO2微球后的孔穴緊密排列，孔穴直徑約220 nm，分子印跡聚合物構成支撐整個膜的聚合物交聯(lián)網(wǎng)狀結構。由于均一多孔的存在，制備的MIPPs具有大的比表面積，并且印跡位點均勻分布在孔穴內外，因此對目標物分子的結合具有傳質快、吸附量大、特異性好等特點。

圖1 (A、B)光子晶體模板與(C)反蛋白石結構 MIPPs的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron microscope images of (A, B) photonic crystal templates and (C) molecular imprinted photonic crystal polymers (MIPPs)

3.3 基于MIPPs膜陣列傳感器的構建

將BPA MIPPs(MIPPs@BPA)、BPA非印跡光子晶體聚合物(NIPPs@BPA)、DCD的 MIPPs(MIPPs@DCD)以及DCD非印跡聚合物(NIPPs@DCD)作為傳感單元，組裝到基質模板，構建陣列傳感器(圖2)。將制備的陣列傳感器置入含有不同濃度的目標分析物樣品溶液中，由于傳感單元上的分子印跡作用，傳感單元上的MIPPs可以特異結合對應的目標分析物，引起衍射峰位移。因此，可以通過傳感單元上的MIPPs衍射峰位移量檢測目標物。構建的基于MIPPs的傳感器陣列不僅保留了傳統(tǒng)分子印跡聚合物和光子晶體的優(yōu)點，還可以同時對BPA和DCD進行檢測，提高了檢測效率,降低了檢測成本，為微量目標物的快速識別分析提供了一種新的檢測方法。

圖2 基于BPA、DCD MIPPs的陣列傳感器制備示意圖：(A)MIPPs@BPA；(B)NIPPs@BPA；(C)MIPPs@DCD；(D)MIPPs@DCDFig.2 Schematic illustration of preparation of a sensor chip based on MIPPs for bisphonel A (BPA) and dicyandiamide (DCD): (A) MIPPs@BPA; (B) NIPPs@BPA; (C) MIPPs@DCD; (D) NIPPs@DCD. PMMA: polymethyl methacrylate

3.4 響應時間

圖3 MIPPs和NIPPs對BPA和DCD的響應時間Fig.3 Response time of MIPPs and NIPPs for BPA and DCD

對不同反應時間下MIPPs和NIPPs的衍射峰位移變化進行了測定。由圖3可知，制備的BPA和DCD的MIPPs都在很短的時間內發(fā)生明顯的位移，并且達到穩(wěn)定，說明構建的MIPPs對目標物響應迅速。與目標溶液分別反應2.5和4.0 min后，BPA與DCD的MIPPs衍射峰位移達到穩(wěn)定。作為對照的NIPPs也出現(xiàn)位移變化，但是位移量較小。這是由于MIPPs上存在與目標物的大小、形狀以及功能基團互補的結合位點，可快速結合大量的目標物分子，從而改變了膜上孔穴的結構，引起明顯的衍射峰位移；而NIPPs主要依靠非特異性吸附結合目標物，因此與目標物分子結合較慢，衍射峰位移不明顯。實驗結果表明，BPA和DCD的MIPPs的響應時間分別為2.5和4.0 min。

3.5 MIPPs對BPA和DCD的測定

分別將BPA和DCD的MIPPs置于不同濃度的樣品溶液中，考察衍射峰位移量。由圖4可知，隨著BPA濃度增大，衍射峰逐漸由539 nm移動紅移到578 nm，最大位移量為39 nm(圖4A)，同時，MIPPs@BPA的顏色也發(fā)生變化，由黃綠色逐漸變化為橘紅色。而BPA的NIPPs衍射峰位移變化不明顯(圖4B)，表明BPA的MIPPs具有特異結合能力，可以通過計算分析或圖像處理軟件進行樣品溶液中BPA的快速定性與定量檢測。DCD MIPPs膜也具有同樣的現(xiàn)象，隨著樣品中DCD濃度增大，MIPPs@DCD的衍射峰由536 nm逐漸位移到567 nm，最大位移量為31 nm(圖4C)。由圖4可知，NIPPs的衍射峰位移較小，最大位移量小于10 nm，且沒有明顯規(guī)律(圖4B和4D)。由圖4E和4F可知，制備的MIPPs@BPA的衍射峰位移在BPA濃度范圍為0.1～5.0 μg/L時，與BPA濃度具有良好的線性關系(R2=0.9964)，檢出限為0.051 μg/L (S/N=3)，低于BPA國家標準限量值(10 μg/L)[33]； MIPPs@DCD在DCD濃度范圍為0.1～10 μg/L時具有良好線性關系(R2=0.9944)，檢出限為0.038 μg/L (S/N=3)。

圖4 (A)MIPPs@BPA、(B) NIPPs@BPA、(C) MIPPs@DCD和(D) NIPPs@DCD在不同濃度對應目標物溶液中的衍射峰圖譜(樣品濃度均為0、1、2、4、6、8、10 μg/L，25℃)；(E) MIPPs@BPA衍射峰位移量與BPA濃度的線性關系；(F)MIPPs@DCD衍射峰位移量與DCD濃度的線性關系。 Δλ： MIPPs衍射峰位移量Fig.4 Diffraction spectra of (A) MIPPs@BPA, (B) NIPPs@BPA, (C) MIPPs@DCD and (D) NIPPs@DCD in different concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg/L, at 25℃) of corresponding target molecule solutions; (E) Linear relationship between diffraction peak shift of MIPPs and concentration of BPA; (F) Linear relationship between the diffraction peak shift of MIPPs and the concentration of DCD. Δλ: diffraction peak shift

3.6 選擇性

考察了BPA和DCD的MIPPs的選擇性，結果如圖5所示。結果表明，MIPPs @BPA置于BPA樣品溶液中后，其衍射峰位移隨BPA濃度增加而增大；而將MIPPs@BPA置于DCD溶液中時，其吸附行為和衍射峰位移量與NIPPs@BPA相似，遠低于其在BPA溶液中的衍射峰位移變化。這說明由于DCD與BPA在結構和功能基團上具有明顯差異，制備的MIPPs@BPA不能選擇性捕獲DCD分子，對DCD分子的結合能力與非印跡光子晶體聚合物類似，都是通過非特異性結合，因此衍射峰位移量變化較小。而將MIPPs@DCD置于BPA樣品溶液中，得到了同樣的結果。實驗結果表明，制備的DCD和BPA MIPPs能夠特異地結合目標物(模板分子)，具有選擇性高、響應快等特點。

圖5 制備的MIPPs陣列傳感器分別在不同濃度(0、 1、 2、 4、 6、 8和10 μg/ L，25℃)的(A)BPA和(B)DCD溶液中最大衍射峰位移變化Fig.5 Diffraction peak shift of MIPPs array sensor in different concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8 and 10 μg/L, at 25℃) of (A) BPA and (B) DCD

3.7 實際樣品分析

采用制備的MIPPs陣列傳感器對環(huán)境水樣中DCD和BPA進行了檢測。由表1可知，將制備的MIPPs陣列傳感器置入環(huán)境水樣中反應4 min后，BPA MIPPs傳感單元的衍射峰發(fā)生了位移，最大位移量分別為(2.0±0.6) nm和(3.0±1.0) nm；而DCD MIPPs傳感單元未能檢出衍射峰變化。在環(huán)境水樣中同時添加BPA和DCD標準品，采用本方法檢測，BPA和DCD MIPPs傳感單元的衍射峰位移均顯著增加，最大位移量分別為(27.0±1.7) nm 和 (18.0±1.0) nm。結果表明，制備的MIPPs陣列傳感器可以有效地檢測實際樣品中BPA和DCD，具有操作簡單、快速、選擇性好和靈敏度高等優(yōu)點。

表1 制備的MIPPs傳感器對環(huán)境水樣中BPA和DCD的檢測

Table 1 Detection of BPA and DCD in environmental water samples by MIPPs array sensors

樣品Sample峰位移量Peak shift (nm, n=3)MIPPs@BPAMIPPs@DCD加標量Added(μg/L)加入后衍射峰的位移量Peak shift after addition (nm, n=3)MIPPs@BPAMIPPs@DCD水樣1Water sample 12.0±0.1.0n.d.水樣2Water sample 23.0±1.0n.d.2.014.0±2.011±1.04.023.0±1.016±1.52.016.0±1.513±1.54.027.0±2.018±1.0n.d. 未檢出 Not detectable

4 結 論

采用分子印跡技術與光子晶體結合，構建了基于MIPPs的傳感器陣列，并用于樣品中BPA和DCD的快速識別分析。制備的傳感器對目標物在較低濃度時就有明顯的衍射峰位移變化，并具有選擇特異性。實驗表明，構建的傳感器陣列具有結構穩(wěn)定、靈敏度高、響應快、選擇性好等優(yōu)點，可以作為一種新方法用于環(huán)境水樣、塑料制品及乳制品中BPA和DCD以及其它小分子物質的識別檢測。