基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測(cè)的輻射損傷防護(hù)化合物活性評(píng)價(jià)

賈廣彥，劉禎，錢(qián)坤，周喆

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.解放軍960醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031

輻射防護(hù)劑是防護(hù)與救治核輻射損傷最為有效和直接的手段之一[1]。隨著電離輻射應(yīng)用領(lǐng)域的增加，輻射防護(hù)藥物需求也愈顯迫切。多年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)人工合成化合物、天然化合物和生物因子在內(nèi)的大量候選藥物進(jìn)行了研究和篩選[2]，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在尋找高效低毒的輻射防護(hù)劑方面進(jìn)展比較緩慢[3]。

老藥重利用（也稱藥物重定位）是基于已有的藥物發(fā)現(xiàn)其新用途，因?qū)ζ涠靖弊饔昧私廨^為清楚，因此開(kāi)發(fā)成功的概率更高，是新藥研發(fā)的有效手段之一[4]。計(jì)算預(yù)測(cè)分析和實(shí)驗(yàn)篩選過(guò)程是老藥新用研究的兩大方法[5]。本單位多年來(lái)從事多組學(xué)數(shù)據(jù)的計(jì)算分析，以探尋已上市藥物新的適用范圍，為新藥研發(fā)提供新的思路方法。任磊[6-7]等利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合輻射損傷特征篩選輻射損傷防護(hù)候選藥物，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證明了巴氯芬、阿米洛利等藥物具有輻射損傷防護(hù)作用，為使用藥物重定位策略尋找有效的輻射損傷防護(hù)藥物提供了有力參考。為從上市藥物中發(fā)現(xiàn)輻射損傷防護(hù)劑，劉禎[8]等利用基于網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞反應(yīng)印記整合文庫(kù)（LINCS）計(jì)劃[9]的小分子化合物刺激不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建算法評(píng)估化合物的輻射損傷防護(hù)作用，預(yù)測(cè)出了299種可能具有輻射損傷防護(hù)作用的藥物。本研究對(duì)基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測(cè)的系列化合物中排名靠前的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了具有輻射損傷防護(hù)作用的藥物來(lái)那度胺，并進(jìn)一步探討了其輻射損傷防護(hù)作用涉及的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性 C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)［SCXK（京）-2019-0010］。

來(lái)那度胺（lenalidomide）、醛脫氫酶-2激動(dòng)劑（ALDA-1）、氨磷?。╓R2721）購(gòu)自 MedChemExpress公司；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀為北京寶靈曼陽(yáng)光科技有限公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 30 d存活率實(shí)驗(yàn)

我們?cè)趧⒌漑8]等預(yù)測(cè)的299種抗輻射藥物中選擇了來(lái)那度胺和ALDA-1于動(dòng)物模型上驗(yàn)證其是否具有輻射損傷防護(hù)作用。C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院SPF級(jí)動(dòng)物房，相對(duì)濕度為50%±10%，12 h燈光12 h黑暗，喂常規(guī)飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前3 d觀察有無(wú)異常。小鼠按體重隨機(jī)分為輻射對(duì)照（等容生理鹽水）組、WR2721（150 mg/kg）組（陽(yáng)性對(duì)照）、來(lái)那度胺（200 mg/kg）組、ALDA-1（5 mg/kg）組，每組10只。2種藥物溶媒為分析純DMSO。每日腹腔注射給藥1次，給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線（軍事醫(yī)學(xué)研究院鈷源）對(duì)各組小鼠進(jìn)行一次性全身照射，照射劑量8 Gy，照射劑量率為69.27 cGy/min。照射后30 d觀察各組小鼠生存情況。

1.3 外周血白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞測(cè)定

由于來(lái)那度胺輻射損傷防護(hù)效果較好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。C57BL/6J小鼠按體重隨機(jī)分為輻射對(duì)照（等容生理鹽水）組、WR2721（150 mg/kg）組（陽(yáng)性對(duì)照）、來(lái)那度胺（200 mg/kg）組，每組10只，每日腹腔注射給藥1次，給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線對(duì)各組小鼠進(jìn)行一次性全身照射，照射劑量6.5 Gy，劑量率為68.33 cGy/min。另取10只同齡C57BL/6J小鼠作為正常組。

照射后第4、7、11、18、21 d照射各組與正常組小鼠尾靜脈取血20 μL，加入3%檸檬酸鈉2 μL抗凝后用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.4 骨髓病理分析

上述6.5 Gy60Co γ射線照射各組與正常組小鼠各2只于照后第14 d取股骨，剔除股骨附著的軟組織，置于4%多聚甲醛固定液中，16 h后常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色后在200倍顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量以x±s表示，采用方差分析（One-Way ANOVA）或秩和檢驗(yàn)。動(dòng)物存活率采用生存分析Log Rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 來(lái)那度胺對(duì)輻射小鼠30 d生存率的影響

經(jīng)8 Gy60Co γ射線照射后30 d，輻射對(duì)照組小鼠存活率為50%，ALDA-1和來(lái)那度胺組小鼠存活率為100%（圖1），說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)來(lái)那度胺、ALDA-1在動(dòng)物模型上具有較好的輻射損傷防護(hù)作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們針對(duì)來(lái)那度胺的輻射損傷防護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。

圖1 來(lái)那度胺對(duì)致死劑量輻射損傷小鼠的保護(hù)作用

2.2 來(lái)那度胺對(duì)輻射損傷小鼠白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

經(jīng)6.5 Gy60Co γ射線照射后，各組小鼠的血液生化指標(biāo)均顯著降低并且隨時(shí)間有不同程度的回升。與輻射對(duì)照組相比，來(lái)那度胺組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠白細(xì)胞數(shù)量回升更早，照射后第11 d輻射對(duì)照組小鼠白細(xì)胞數(shù)量還在降低，而來(lái)那度胺組和陽(yáng)性對(duì)照組已顯示出白細(xì)胞的恢復(fù)，照射后第21 d各組小鼠白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至相近水平，以來(lái)那度胺組略優(yōu)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。來(lái)那度胺組和陽(yáng)性對(duì)照組照射后淋巴細(xì)胞回升趨勢(shì)好于輻射對(duì)照組，相比差異顯著（P＜0.05）（表2）。在血小板回升過(guò)程中，來(lái)那度胺組和陽(yáng)性對(duì)照組不僅回升趨勢(shì)好于輻射對(duì)照組，并且第21 d恢復(fù)程度也明顯優(yōu)于輻射對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。可見(jiàn)來(lái)那度胺可減少白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量下降的程度，并有助于其恢復(fù)。

表1 來(lái)那度胺對(duì)輻射小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響

表2 來(lái)那度胺對(duì)輻射小鼠淋巴細(xì)胞百分比的影響

表3 來(lái)那度胺對(duì)輻射小鼠血小板數(shù)量的影響

2.3 來(lái)那度胺對(duì)輻射小鼠骨髓脂肪化和細(xì)胞增生的影響

HE染色切片（圖2）顯示，正常組小鼠股骨骨髓未見(jiàn)脂肪滴，細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞增生明顯，骨髓細(xì)胞排列緊密；輻射對(duì)照組小鼠骨髓重度脂肪滴化，內(nèi)有重度出血，骨髓造血細(xì)胞缺乏，細(xì)胞增生不明顯，重度骨髓細(xì)胞耗竭；來(lái)那度胺組小鼠股骨骨髓輕度脂肪滴化，骨髓輕度出血，骨髓細(xì)胞增生，輕度骨髓細(xì)胞耗竭；WR2721組小鼠骨髓輕度脂肪滴化，骨髓內(nèi)有輕度出血，骨髓細(xì)胞顯著增生。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示來(lái)那度胺可減輕全身照射誘導(dǎo)的小鼠骨髓脂肪化，減少骨髓出血，促進(jìn)骨髓增生，表明其輻射防護(hù)機(jī)制可能涉及保護(hù)小鼠造血系統(tǒng)，減輕造血組織的損傷。

圖2 來(lái)那度胺對(duì)輻射損傷小鼠骨髓組織形態(tài)的影響（HE×200）

3 討論

輻射損傷防護(hù)藥物在國(guó)防、反恐、和平利用原子能等方面都有很大價(jià)值[10]，經(jīng)過(guò)近半世紀(jì)的努力，抗輻射損傷藥物研究已取得一些進(jìn)展，有些藥物已應(yīng)用于臨床，包括氨硫基類化合物、細(xì)胞因子類、激素類、天然藥物等[11]?，F(xiàn)有的輻射損傷防護(hù)作用藥物仍存在許多的問(wèn)題，如多數(shù)防護(hù)藥物作用單一，無(wú)法滿足對(duì)中重度急性輻射損傷患者治療的需求[12]，有些藥物毒性低但防護(hù)效價(jià)低、有效時(shí)間短[13]，有些藥物防護(hù)效價(jià)較高但不良反應(yīng)大[14]，因此尋找高效低毒的新型抗輻射藥物仍然具有重要意義。

藥物重定位是發(fā)掘已知藥物的新用途，探尋其新的適用范圍，由于基于已上市藥物，該策略可降低開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，研發(fā)效率高[15]。十幾年來(lái)，各類組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展和廣泛應(yīng)用[16]，積累了多組學(xué)、多層次的海量數(shù)據(jù)，使生物醫(yī)學(xué)進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代，大數(shù)據(jù)分析為發(fā)現(xiàn)新的藥物作用模式[17]、藥物作用機(jī)理辨識(shí)、藥物重定位[18]等提供了新的技術(shù)方法。基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測(cè)抗輻射藥物，是一種基于化合物或藥物基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)已上市藥物新用途的方法。此模式基于臨床已經(jīng)使用的藥物，其藥物作用特點(diǎn)研究比較充分。本研究對(duì)基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測(cè)的抗輻射藥物的防護(hù)作用進(jìn)行了驗(yàn)證，篩選出具有抗輻射活性的結(jié)構(gòu)來(lái)那度胺。來(lái)那度胺是第二代免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗血管生成、改善免疫功能、腫瘤殺傷和改變骨髓微環(huán)境等多種作用機(jī)制，已上市多年，臨床上用于好幾種血液病的治療[19]。本研究發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物模型上具有輻射損傷防護(hù)作用，提示其進(jìn)一步研發(fā)為輻射防護(hù)劑的可能性。本研究也以實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)依據(jù)證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在抗輻射藥物重定位研究中的有效性，為發(fā)現(xiàn)新型防輻射損傷化學(xué)結(jié)構(gòu)提供了方法學(xué)參考。