新型冠狀病毒N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原的克隆表達(dá)及其診斷價(jià)值初步評(píng)價(jià)

王坤，張玲，王超男，陳遠(yuǎn)哲，范占科，李垚，劉念，馮曉燕，付強(qiáng)，張賀秋，

1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071

2019年底，全球陸續(xù)出現(xiàn)了一系列原因不明的肺炎病例，2020年2月11日，國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）將該病原體新型冠狀病毒正式命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus2，SARS-CoV-2），世界衛(wèi)生組織（WHO）將這一病毒導(dǎo)致的疾病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]。SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒β屬，其遺傳物質(zhì)是單正鏈RNA，基因組包含29 891個(gè)核苷酸，與2003年暴發(fā)的SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的同源性為82%。SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)蛋白主要包括棘突糖蛋白（S）、包膜糖蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。N蛋白與基因組RNA形成復(fù)合物，在病毒粒子組裝過程中與病毒膜蛋白相互作用，在提高病毒轉(zhuǎn)錄和組裝效率方面起關(guān)鍵作用。同時(shí)，N蛋白相對(duì)保守，在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，感染早期機(jī)體就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體[2]。

血清學(xué)改變是COVID-19患者疾病發(fā)展過程中的普遍事件，會(huì)發(fā)生在感染的早期并一直持續(xù)至感染后期，甚至康復(fù)期。檢測COVID-19患者血清中產(chǎn)生的抗體，可做到早診斷、早隔離、早治療。病毒感染時(shí)，血清中出現(xiàn)的抗體主要是IgM和IgG。IgM抗體表明活躍或最近的感染；IgG抗體在感染中出現(xiàn)較晚，通常表明既往感染，但不排除最近感染的患者，這些患者可能仍然具有傳染性，特別是當(dāng)同時(shí)檢測到IgM抗體時(shí)[3]。為了提高抗體檢測試劑的性能，我們利用生物學(xué)軟件分析了N蛋白氨基酸序列的B細(xì)胞表位分布及疏水性，選取含有優(yōu)勢表位的抗原區(qū)段進(jìn)行克隆表達(dá)，并對(duì)其診斷價(jià)值進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

23例經(jīng)臨床確診的COVID-19患者血清標(biāo)本、20例乙肝患者血清樣本和40例健康體檢者血清樣本均由廣州市第八人民醫(yī)院提供。大腸桿菌BL21、質(zhì)粒pColdi為本室保存；DNA限制內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ購自Promega公司；HRP標(biāo)記的抗人IgG、IgM二抗購自Bethyl公司。

1.2 N蛋白抗原性分析及優(yōu)勢表位區(qū)段篩選

采用BIOSUN生物信息學(xué)軟件分析新型冠狀病毒N蛋白氨基酸序列，首先輸入全長序列，然后利用B細(xì)胞表位分析功能，根據(jù)表位峰值的高低篩選確定優(yōu)勢表位區(qū)段。

1.3 N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

由北京諾賽生物技術(shù)有限公司合成N蛋白優(yōu)勢表位抗原的編碼基因，采用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，通過雙酶切，將N蛋白優(yōu)勢表位抗原的編碼基因插入同樣經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的pColdi質(zhì)粒，獲得pColdi-NP重組質(zhì)粒。

1.4 抗原純化及制備

將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于3 mL含氨芐西林鈉的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日接種于250 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min培養(yǎng)4 h至對(duì)數(shù)生長期，加150 μL 1 mol/L 的 IPTG，15℃誘導(dǎo)12～14 h，4℃、6000 r/min離心10 min收集菌體；用25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）重懸菌體，冰浴超聲，4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清，過濾備用。Ni柱純化，平衡后，將處理好的樣品緩慢上樣，待吸光度值開始上升時(shí)收集穿過液；平衡后，依次用含25、250 mmol/L 咪唑的 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.5）溶液洗脫，分別收集蛋白峰，電泳分析純化產(chǎn)物，驗(yàn)證純化后的目的蛋白。

1.5 抗原純度及相對(duì)分子質(zhì)量測定

利用Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows軟件分析純化后N蛋白優(yōu)勢表位抗原的相對(duì)分子質(zhì)量和純度。

1.6 N蛋白優(yōu)勢表位抗原活性鑒定

采用Biocore結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測抗原抗體的相互作用，分別用PBS以1∶100稀釋陽性血清和陰性血清。傳感器預(yù)處理后，以5 μL/min的速率通入血清進(jìn)行抗體綁定，通入時(shí)間分別為1.2 min。隨后將1 mg/mL N蛋白優(yōu)勢表位抗原以30 μL/min的速率通入進(jìn)行結(jié)合，通入時(shí)間為6 min。解離時(shí)間與結(jié)合時(shí)間相同。

1.7 ELISA法鑒定N蛋白優(yōu)勢表位抗原活性和特異性

采用ELISA方法檢測人血清樣本中抗新型冠狀病毒N蛋白IgM/IgG抗體。用碳酸鹽包被緩沖液（pH9.6）稀釋N蛋白優(yōu)勢表位抗原，濃度為2.5 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃過夜；用洗滌液洗板2 次，200 μL/孔；加入 110 μL/孔封閉液（0.01 mol/L PBS，1%BSA，pH7.2），室溫封閉6 h；用洗滌液洗板 5 次，200 μL/孔；真空干燥 4～6 h。檢測時(shí)，每孔加入100 μL樣品稀釋液后，分別加入5 μL待測血清，37℃反應(yīng)30 min，棄液，用洗滌液洗板 5 次，300 μL/孔，拍干，加入 100 μL/孔 HRP標(biāo)記的抗人IgM/IgG抗體，37℃孵育20 min；用洗液洗板5次，200 μL/孔；加入TMB顯色底物A、B液各50 μL，充分混勻，37℃避光反應(yīng)10 min；加入 50 μL/孔 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，終止后 10 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀測定各孔的D450nm值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪制ROC曲線，以約登指數(shù)最大判斷Cut-off值，≥Cut-off值判定為陽性，＜Cut-off值判定為陰性，并計(jì)算靈敏度與特異性。

2 結(jié)果

2.1 新型冠狀病毒N蛋白優(yōu)勢表位抗原區(qū)段的確定

利用BIOSUN生物學(xué)軟件分析尋找B細(xì)胞表位，根據(jù)表位分布圖最終確定N蛋白優(yōu)勢表位抗原區(qū)段為15～215 aa（圖1）。

圖1 新型冠狀病毒N蛋白B細(xì)胞表位分析

2.2 抗原表達(dá)、純化與鑒定

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，Ni柱純化后獲得純化抗原，電泳分析純化產(chǎn)物，驗(yàn)證純化后的目的蛋白在250 mmol/L咪唑洗脫液中（圖2）。Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for Windows軟件分析結(jié)果表明，純化后N蛋白優(yōu)勢表位抗原的相對(duì)分子質(zhì)量為28.10×103，純度為96.23%（圖3）。

圖2 N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原SDS-PAGE鑒定

圖3 N蛋白優(yōu)勢表位抗原相對(duì)分子質(zhì)量（A）和純度（B）分析

2.3 N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原活性的初步評(píng)價(jià)

采用Biocore結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測抗原抗體的相互作用，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)見表1。ka為結(jié)合速率常數(shù)，反映大分子間的作用結(jié)合速度；kd為解離速率常數(shù)，反映分子復(fù)合物解離速度；KD為解離平衡常數(shù)（KD=kd/ka）。結(jié)果顯示，陽性血清與N蛋白優(yōu)勢表位抗原的結(jié)合速率常數(shù)顯著高于陰性血清，同時(shí)，陽性血清與N蛋白優(yōu)勢表位抗原的解離速率常數(shù)顯著低于陰性血清。

表1 抗原抗體結(jié)合力分析

2.4 COVID-19患者血清中的IgM、IgG抗體檢測

用N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原包被酶聯(lián)板，間接ELISA法對(duì)23例經(jīng)臨床確診的COVID-19患者血清標(biāo)本、20例乙肝患者和40例健康體檢者血清樣本進(jìn)行抗N抗原IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果如圖4。COVID-19患者血清中IgM和IgG抗體水平均顯著高于健康體檢者和乙肝患者組（P＜0.0001）。根據(jù)ROC曲線，IgM抗體診斷COVID-19的AUC值為0.797，IgG抗體診斷COVID-19的AUC值為0.998。對(duì)于IgM檢測，以約登指數(shù)最大時(shí)的D450nm=0.123為臨界值，IgM對(duì)COVID-19檢測的靈敏度為 60.87%（14/23），特異性為 90%（36/40）。對(duì)于IgG檢測，以約登指數(shù)最大時(shí)的D450nm=0.178為臨界值，IgG對(duì)COVID-19檢測的靈敏度為95.65%（22/23），特異性為100%（40/40）。

圖4 N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段抗原血清學(xué)檢測性能

3 討論

2019年12月暴發(fā)的COVID-19感染性疾病在全球蔓延，成為國際關(guān)注的重大突發(fā)事件，據(jù)報(bào)道人與人之間的傳播潛伏期為2～14 d，通過飛沫、受污染的手或物體表面?zhèn)鞑4]。隨著SARSCoV-2感染的流行，迫切需要一種準(zhǔn)確、快速、低成本的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷方法。COVID-19流行數(shù)據(jù)表明，血清學(xué)反應(yīng)，尤其是病毒特異性IgM和IgG，是有效的血清學(xué)輔助診斷標(biāo)志物[5]，有助于COVID-19的診斷，包括PCR結(jié)果陰性或無臨床癥狀的感染者[6]。冠狀病毒所編碼的抗原中，N蛋白具有較高的免疫原性，可在早期感染時(shí)分泌到體液中，有可能作為抗原檢測的生物標(biāo)志物，同時(shí)抗N蛋白抗體可被用于檢測冠狀病毒感染[7]。

本研究為了獲得高活性N蛋白抗原，通過生物學(xué)軟件分析選取了優(yōu)勢表位區(qū)段抗原并獲得了高效表達(dá)，采用Biocore結(jié)合實(shí)驗(yàn)初步確定15～215 aa優(yōu)勢表位區(qū)段抗原可以與COVID-19患者血清樣本發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。接下來放大樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示基于本研究優(yōu)勢表位區(qū)段抗原所建立的IgM和IgG檢測方法可以很好地區(qū)分COVID-19患者和健康對(duì)照，尤其是IgG檢測具有優(yōu)異的檢測性能。

在本研究中，抗NP-IgM（90%）和抗NP-IgG（100%）檢測的特異性均較高，但本次實(shí)驗(yàn)檢測的COVID-19患者中抗NP-IgG的陽性率（95.65%）卻顯著高于抗NP-IgM的陽性率（60.87%），這可能是由于IgM抗體出現(xiàn)在感染最早期，抗NP-IgM的血清轉(zhuǎn)化發(fā)生在發(fā)病后7～12 d，而有些患者則發(fā)生在癥狀出現(xiàn)后1 d[8]。隨著感染時(shí)間延長，一些患者的IgM抗體發(fā)生陰轉(zhuǎn)，繼而出現(xiàn)IgG抗體。血清中抗體的轉(zhuǎn)化時(shí)間是因人而異的，同樣，由于病情嚴(yán)重程度不同，患者的血清學(xué)反應(yīng)也會(huì)有所不同[9]。本研究入組的COVID-19患者均已確診并入院治療，并非全部為早期感染者，所以NP-IgM的陽性率較低。根據(jù)本研究結(jié)果綜合考慮，抗NP-IgG和抗NP-IgM對(duì)COVID-19的鑒別診斷都有價(jià)值，在早期篩查診斷中應(yīng)該將兩者聯(lián)合使用，以提高診斷效率和篩查準(zhǔn)確率。而在大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中，由于IgG在患者體內(nèi)存在時(shí)間更長久，NP-IgG是更好的檢測標(biāo)志物。

據(jù)報(bào)道，COVID-19抗體檢測方法還可檢測針對(duì)SARS-CoV-2中S蛋白的血清IgM/IgG抗體[10]。研究發(fā)現(xiàn)，抗N蛋白與抗S蛋白抗體聯(lián)合檢測可在發(fā)病后1周內(nèi)將陽性率從41.7%顯著提高至75%[11-12]，將抗N蛋白抗體與抗S蛋白抗體檢測相結(jié)合，是提高COVID-19篩查能力的更有效策略。因此，為了進(jìn)一步提高抗體檢測的靈敏度，我們?cè)诤笃谘芯恐性O(shè)計(jì)將易表達(dá)的N蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段與難表達(dá)的S蛋白優(yōu)勢表位區(qū)段構(gòu)建成一個(gè)融合表達(dá)抗原，進(jìn)一步提高檢測的靈敏度和特異性。