云南省永德縣豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查

呂 濤 舒相華,2 羅班乾 趙金明 彥洪奎 宋春蓮*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2昆明偉牧得生物科技有限公司，云南昆明 650201；3云南省永德縣畜牧獸醫(yī)局，云南永德 677600）

豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，可造成公豬的睪丸出現(xiàn)萎縮或腫脹、未妊娠母豬出現(xiàn)配種不孕，妊娠母豬多表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等[1]；新生仔豬感染PRV后，通常表現(xiàn)口吐白沫、角弓反張等不同的神經(jīng)癥狀，嗜睡、鳴叫、嘔吐、拉稀，1～2 d內(nèi)死亡，發(fā)病率和死亡率可達到100%[2]；育肥豬感染的潛伏期為3～5 d，表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀、增重遲緩、飼料報酬降低、上市時間推遲[3]，育肥豬呼吸困難、生長停滯等[4]。PRV屬于DNA病毒，皰疹病毒屬，其主要存活于腦和脊髓中[5]，可在豬體內(nèi)建立潛伏感染，其宿主范圍很廣，豬是其自然宿主和傳染源之一[6]，病毒在豬體內(nèi)可以長期潛伏存在，可持續(xù)帶毒1年以上[7]。PRV主要通過公豬精液、母豬胎盤傳播，亦可以水平傳播[8]，攜帶PRV的貓、鼠、犬、豬等動物可通過唾液、汗液、乳液等分泌物持續(xù)向外散毒，病毒在體外通過飼料、尿液、水等途徑傳播擴散[9]。本病一年四季都可發(fā)生，但以冬春兩季和產(chǎn)仔旺季多發(fā)[10]。

近年來，偽狂犬病感染率呈現(xiàn)出上升的趨勢，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，使養(yǎng)殖者蒙受巨大的經(jīng)濟損失[11]。為了解云南省永德縣規(guī)模化養(yǎng)豬場豬偽狂犬病感染和疫苗免疫情況，本試驗用PCR檢測方法和ELISA檢測方法對云南省永德縣豬偽狂犬病在種豬之間的流行情況進行調(diào)查研究，為全縣豬偽狂犬病凈化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 樣品來源

云南省永德縣2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)229頭種母豬，前腔靜脈采血5 mL，離心后取上層血清。30頭公豬采集精液原液5 mL，置于－4℃保存，備用。

1.2 主要儀器

單道和8道可調(diào)移液器；電熱恒溫箱（型號：DHG－9240A）；離心機（型號：TDL－40F），購自無錫市瑞江分析儀器有限公司；酶標(biāo)儀（型號：DWB－96G），購自廣州泰思儀器設(shè)備有限公司；PCR擴增儀（型號：846-X-070-301），購自德國耶拿分析儀器股份公司；電泳儀（型號：BAYGENE），購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號：WD-94213B）等。

1.3 主要試劑

⑴豬偽狂犬病感染抗體和免疫抗體ELISA檢測試劑盒（生產(chǎn)批號：190504），購自無錫優(yōu)聯(lián)生物科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒（生產(chǎn)批號：020181108），購自北京擎科生物科技有限公司。

⑵引物參照GenBank中PRV MinA株gE基因序列（Accession No.：AY170318），采用 Primer 5.0軟件設(shè)計了1對檢測引物。P1：5′-TCGGACAGGAAGGACACCAT-3′，P2：5′-CTACGAGGACTACAACTACG-3′。

2 方法

2.1 PCR抗原檢測方法

⑴病毒核酸提取方法參考北京擎科生物科技有限公司生產(chǎn)的動物基因組提取試劑盒說明書；檢測了30頭公豬精液的PRV抗原。

⑵PCR擴增及鑒定。PCR擴增體系為：Premix Taq（ TaKaRaTaq Version 2.0plusdye） 12.5 μL、Sterilized ddH2O10.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性 5 min；94℃50 s，61℃50 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存。

⑶瓊脂凝膠電泳。稱取瓊脂粉0.5 g，溶于50 mL蒸餾水中，配成濃度為1%的瓊脂糖凝膠。

2.2 ELISA抗體檢測方法

采用ELISA法檢測母豬的血清疫苗抗體和野毒抗體，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進行，主要步驟為設(shè)置陰性、陽性、空白對照，稀釋，加樣，溫育，洗板，加酶標(biāo)底物，再洗板，顯色，終止反應(yīng)。使用進口IDEXX公司的試劑盒在酶標(biāo)儀上650 nm波長處測定各孔的OD值。試驗成立條件：陰性對照平均OD值－陽性對照平均OD值≥0.4，用S（樣品孔OD值）/N（陰性對照平均OD值）值來判定檢測結(jié)果，若S/N值≤0.6，樣品判為陽性；若0.6＜S/N值≤0.7，樣品判為可疑，需重新測定；若S/N值＞0.7，樣品判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗原PCR檢測結(jié)果

對永德縣2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)部分供精站30頭種公豬精液進行PCR抗原檢測，電泳結(jié)果顯示30份核酸樣品PRV抗原均為陰性；說明30頭種公豬未感染PRV。見圖1。

3.2 免疫抗體與感染抗體檢測結(jié)果

母豬PRV gB-ELISA即免疫抗體陽性率為57.89%，gE-ELISA即感染抗體陽性率為3.10%，總體結(jié)果表明免疫保護率較低，野毒感染率較低。見表1。

表1 PRV gB、gE抗體檢測結(jié)果

4 討論

⑴根據(jù)PCR檢測抗原結(jié)果，試驗的30頭種公豬均未感染PRV，這可能與永德縣四面環(huán)山的特殊地理環(huán)境所形成的天然屏障保護的作用有關(guān)，田輝等[12]發(fā)現(xiàn)秦嶺對冬夏季風(fēng)的屏障作用引起的氣候差異，是導(dǎo)致秦嶺南北手足口病流行特征不同的主要因素。夏爐明等[13]對上海市規(guī)模豬場豬偽狂犬病傳播風(fēng)險因素的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“1年內(nèi)引進種豬”“引進公豬精液”是導(dǎo)致PRV場間傳播的主要危害性因素之一，“引種/引進精液時檢測PRV gE抗體”為主要保護性因素。因此建議利用好該縣地理位置的優(yōu)勢，采用自繁自養(yǎng)的養(yǎng)殖方式更有利于偽狂犬病的防控凈化。

⑵永德縣PRV gB免疫抗體陽性率為57.89%，低于謝相悅等[14]研究的云南省昌寧縣種母豬的PRV免疫抗體陽性率（80.30%），也低于彭澤琴等[15]報道的臨滄地區(qū)規(guī)?；i場和散養(yǎng)戶的PRV免疫抗體陽性率（73.16%）。當(dāng)免疫抗體陽性率低時，說明疫苗保護力差，豬只對PRV的抵抗能力弱，若PRV侵入將會給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失。PRV感染抗體陽性率為3.10%，低于畢峻龍等[16]對2009—2013年云南省楚雄地區(qū)豬偽狂犬病野毒感染的調(diào)查結(jié)果（感染抗體陽性率31.70%），低于謝香悅等[14]對云南省昌寧縣種母豬PRV野毒感染的調(diào)查結(jié)果（感染抗體陽性率為4.84%）；與吳程華等[17]對云南省楚雄地區(qū)散養(yǎng)戶154頭豬血清進行PRV野毒感染的調(diào)查結(jié)果（gE感染抗體陽性率為25.32%）相比較低。

與云南省不同地區(qū)的豬群豬偽狂犬病調(diào)查結(jié)果相比較，PRV免疫抗體陽性率低于楚雄、臨滄、昌寧等地區(qū)，感染抗體陽性率低于楚雄、昌寧等地區(qū)。分析原因可能是由于當(dāng)?shù)胤酪咭庾R比較薄弱，對豬偽狂犬病疫苗接種力度不夠。

⑶永德縣豬偽狂犬病野毒感染陽性率處在較低水平，利于豬偽狂犬病的防控凈化。因此要消滅傳染源，有效防控本病。第一，要嚴(yán)格做好種豬監(jiān)測，不引進帶毒種豬，并淘汰本場帶毒豬；第二，要對發(fā)病豬場的病死動物尸體、死胎、流產(chǎn)物和其他污染物、排泄物銷毀，做無害化處理，同時加強衛(wèi)生消毒[19]。

5 結(jié)論

云南省永德縣2019年豬偽狂犬病調(diào)查表明，豬偽狂犬病疫苗免疫保護力較低，應(yīng)加強疫病監(jiān)測和疫苗免疫；野毒感染陽性率較低，有利于實施豬偽狂犬病凈化，定期檢測種公豬，嚴(yán)格淘汰陽性豬，為永德縣豬偽狂犬病凈化打下堅實基礎(chǔ)。