大黃素甲醚氨基酸衍生物的合成及其殺菌活性

孟振國, 朱 祥, 趙熾娜, 常 悅, 吳清來, 李俊凱,2*

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025； 2.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)藥研究所,湖北 荊州 434025)

目前，發(fā)展和創(chuàng)制綠色農(nóng)藥已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)基本保證。為此，人們?cè)谥参镌刺烊划a(chǎn)物中尋找有活性的新藥或者先導(dǎo)化合物，并利用其開發(fā)出具有活性高、選擇性強(qiáng)、安全低毒和環(huán)境友好型的農(nóng)藥新品種，這也是未來農(nóng)藥的發(fā)展趨勢(shì)[1-4]。大黃素甲醚是從蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. Et Zncc)等植物中提取出來的一類蒽醌化合物[5]，是大黃重要的成分之一[6]，屬單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物。大黃素甲醚被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，具有抗腫瘤、抗病毒和修復(fù)受損DNA等生理活性[7-9]，近年也在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域開始有所運(yùn)用。薛敏峰等[10]通過田間藥效試驗(yàn)表明0.5%大黃素甲醚水劑對(duì)各類白粉病菌有明顯優(yōu)于其他同類藥劑的防治效果；楊宇紅等[11]采用溫室盆栽法表明大黃素甲醚對(duì)植物病原菌黃瓜白粉病菌表現(xiàn)出顯著的抑制活性。作為一種天然產(chǎn)物，大黃素甲醚的蒽醌結(jié)構(gòu)通常具有較強(qiáng)的抑菌活性[12]。同時(shí)，氨基酸也是自然界常見的具有重要生理與結(jié)構(gòu)功能的小分子化合物，常作為重要的化工原料被廣泛應(yīng)用到新農(nóng)藥研制中，含酰胺結(jié)構(gòu)的化合物在除草、殺蟲、殺菌上有一定的生物活性[13-15]，因此，本研究借助溴乙酸乙酯作為橋鏈將大黃素甲醚與氨基酸類化合物耦合，引入酰胺基，設(shè)計(jì)合成系列結(jié)構(gòu)新穎、簡(jiǎn)便易得的新型大黃素甲醚氨基酸衍生物，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了篩選，以期為合成抑菌活性更好的大黃素甲醚衍生物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

大黃素甲醚、氯化亞砜(純度98%)、二氯甲烷(DCM)、二甲基亞砜(DMSO)、 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺(Et3N)、 1,4-二氧雜環(huán)己烷(二氧六環(huán))、溴乙酸乙酯和各類氨基酸酯鹽酸鹽及其他試劑均為市售分析純。

水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKuhn)、水稻稻瘟病菌(PyriculariaoryzaeCavara)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary)、草莓灰霉病菌(BotrytiscinereaPersoon)、煙草赤星病菌(Alterariaalternate(Fr)Keissler)和香樟炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPena.) ，由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。

Varian- 400 型核磁共振儀，以CDCl3和DMSO-d6為溶劑，以 TMS為內(nèi)標(biāo)；Thermo Scientific Q ExactiveTM液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 合成方法

1.2.1中間產(chǎn)物2a～4a的合成 參考文獻(xiàn)[16]方法。稱取4 g 大黃素甲醚、10 g 無水碳酸鉀和800 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于1 000 mL的圓底燒瓶，攪拌5 min后，加入2.8 g 溴乙酸乙酯，室溫下攪拌過夜，薄層層析(TLC)，展開劑為V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2的混合液，跟蹤至反應(yīng)基本結(jié)束，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，抽濾，烘干得黃色粗產(chǎn)物。用硅膠柱層析純化，洗脫劑為V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶3的混合液，得化合物2a，其為同分異構(gòu)體(2a1和2a2),黃色固體4.0 g。

參考文獻(xiàn)[17]方法,將4.0 g黃色固體2a用二氧六環(huán)溶解于250 mL圓底燒瓶，加入1.7 g LiOH·H2O的水溶液，常溫?cái)嚢? h，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，抽濾，烘干得黃色粗產(chǎn)物3a,其為同分異構(gòu)體(3a1和3a2)。

參考文獻(xiàn)[18]方法，稱取2.0 g3a和60 mL二氯甲烷于500 mL的圓底燒瓶，加入三滴DMF和5.0 g 氯化亞砜，冷凝回流過夜，減壓蒸出多余氯化亞砜，留下化合物4a1和4a2不經(jīng)純化用50 mL二氯甲烷溶解，直接用于后續(xù)反應(yīng)。

1.2.2化合物(5a～5i)的合成通法 以5a合成為例。參考文獻(xiàn)[18]方法，稱取0.71 g甘氨酸乙酯鹽酸鹽和2.1 g三乙胺縛酸劑(物質(zhì)的量比1 ∶5)用50 mL二氯甲烷溶解于100 mL圓底燒瓶，室溫?cái)嚢?0 min，將游離出的甘氨酸乙酯加入到1.2.2節(jié)的圓底燒瓶中，室溫反應(yīng)5 h，薄層層析，展開劑為V(乙酸乙酯) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶8 的混合液，跟蹤至反應(yīng)基本結(jié)束，用硅膠柱層析，洗脫劑為V(乙酸乙酯) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶8的混合液，純化得黃色固體。

1.2.3化合物(6a～6h)的合成通法 參考文獻(xiàn)[17]方法。將1.0 g5a異構(gòu)體(5a1和5a2)的黃色固體用二氧六環(huán)溶解，按物質(zhì)的量比1 ∶5加入0.5 g LiOH·H2O的水溶液，常溫?cái)嚢? h，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，抽濾，烘干得黃色產(chǎn)物6a。同樣方法分別合成6b～6h，具體合成路線見圖1。

圖1 大黃素甲醚氨基酸衍生物的合成路線

1.3 結(jié)構(gòu)表征

以 CDCl3和DMSO-d6為溶劑，用核磁共振儀進(jìn)行1H NMR(400 MHz) 分析; 用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行HRMS (M+),m/z分析。

1.4 殺菌活性測(cè)定

以大黃素甲醚為陽性對(duì)照，二甲基亞砜(DMSO)為空白對(duì)照，采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]，在產(chǎn)物濃度為0.2 mmoL/L的條件下測(cè)殺菌活性。于(24±1) ℃ 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)處理采用十字交叉法測(cè)量其菌絲擴(kuò)展直徑，按式(1)計(jì)算抑制率。采用DPS7.05進(jìn)行差異顯著性分析。

相對(duì)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

本研究合成一系列的異構(gòu)體化合物(5a～6h)，選擇部分化合物5a、5b、6a、6c和6e進(jìn)行表征(其余化合物的表征數(shù)據(jù)見輔助材料)。

化合物5a1：1-大黃素甲醚氧乙?；拾彼嵋阴ィ肿邮紺22H21NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.92 (d,J=16.8 Hz, 1H, NH ), 7.60 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.50 (d, 1H, H-5), 7.10 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-4), 6.66 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.67 (d,J=11.6 Hz, 2H, H-17), 4.30 (q,J=7.2 Hz, 2H, H-19), 4.24 (d,J=5.6 Hz, 2H, H-21), 4.00 (s, 2H, H-15), 3.94 (s, 1H, H-15), 2.52 (s, 1H, H-16), 2.45 (s, 2H, H-16), 1.33 (t,J=7.2 Hz, 3H, H-22)；HRMS (M+),m/z：428.133 3。

化合物5a2：8-大黃素甲醚氧乙?；拾彼嵋阴?，分子式C22H21NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.92 (d,J=16.8 Hz, 1H, NH ), 7.80 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.33 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-5), 7.00 (d,J=2.4 Hz, 1H, H- 4), 6.72 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.67 (d,J=11.6 Hz, 2H, H-17), 4.30 (q,J=7.2 Hz, 2H, H-19), 4.24 (d,J=5.6 Hz, 2H, H-21), 4.00 (s, 2H, H-15), 3.94 (s, 1H, H-15), 2.52 (s, 1H, H-16), 2.45 (s, 2H, H-16), 1.33 (t,J=7.2 Hz, 3H, H-22)；HRMS (M+),m/z：428.133 3。

化合物5b1：1-大黃素甲醚氧乙?；彼嵋阴ィ肿邮紺20H17NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.95 (dd,J=16.8, 7.3 Hz, 1H, NH), 7.61 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.50 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.11 (dd,J=1.6, 0.8 Hz, 1H, H- 4), 6.66 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.71 (q,J=7.2 Hz, 1H, H-19), 4.64 (d,J=11.6 Hz, 2H, H-17), 4.27 (q,J=7.2 Hz, 2H, H-21), 4.00 (s, 2H, H-15), 3.94 (s, 1H, H-15), 2.52 (s, 1H, H-16), 2.45 (s, 2H, H-16), 1.59 (d,J=7.2 Hz, 3H, H-24), 1.31 (t,J=7.2 Hz, 3H, H-22)；HRMS (M+),m/z：442.148 5。

化合物5b2：8-大黃素甲醚氧乙酰基丙氨酸乙酯，分子式C20H17NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ：8.95 (dd,J=16.8, 7.3 Hz, 1H, NH), 7.81 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.33 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.01 (dd,J=1.6, 0.9 Hz, 1H, H- 4), 6.72 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.71 (q,J=7.2 Hz, 1H, H-19), 4.64 (d,J=11.6 Hz, 2H, H-17), 4.27 (q,J=7.2 Hz, 2H, H-21), 4.00 (s, 2H, H-15), 3.94 (s, 1H, H-15), 2.52 (s, 1H, H-16), 2.45 (s, 2H, H-16), 1.59 (d,J=7.2 Hz, 3H, H-24), 1.31 (t,J=7.2 Hz, 3H, H-22)；HRMS (M+),m/z：442.148 5。

化合物6a1：1-大黃素甲醚氧乙酰基甘氨酸，分子式C29H27NO9，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：12.97 (s, 1H, H-8), 12.84 (s, 1H, H-20), 8.56 (t,J=5.6 Hz, 1H, NH), 7.48 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.31 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.18 (d,J=1.6 Hz, 1H, H- 4), 7.03 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.80 (d,J=16.4 Hz, 2H, H-17), 4.04 (dd,J=5.6, 2.8 Hz, 2H, H-19), 3.98 (s, 3H, H-15), 2.42 (s, 3H, H-16)；HRMS (M+),m/z：400.102 0。

化合物6a2：8-大黃素甲醚氧乙酰基甘氨酸，分子式C29H27NO9，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.17 (s, 1H,H-8), 12.84 (s, 1H, H-20), 8.56 (t,J=5.5 Hz, 1H, NH), 7.66 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.42 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.15 (d,J=1.5 Hz, 1H, H- 4), 6.85 (d,J=2.5 Hz, 1H, H-2), 4.76 (d,J=16.4 Hz, 2H, H-17), 4.04 (dd,J=5.6, 2.8 Hz, 2H, H-19), 3.92 (s, 3H, H-15), 2.47 (s, 3H, H-16)；HRMS (M+),m/z：400.102 0。

化合物6b1：1-大黃素甲醚氧乙酰基丙氨酸，分子式C24H25NO8S，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.02 (s, 1H, H-8), 12.93 (s, 1H, H-20), 8.64 (d,J=7.2 Hz, 1H, NH), 7.44 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.26 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.14 (d,J=1.2 Hz, 1H, H- 4), 6.98 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.72 (dd,J=15.2, 2.8 Hz, 2H，H-17), 4.38 (p,J=7.2 Hz, 1H, H-19), 3.93 (d,J=20.4 Hz, 3H, H-15), 2.42 (d,J=17.6 Hz, 3H, H-16), 1.44 (dd,J=7.2, 1.6 Hz, 3H, H-21)；HRMS (M+),m/z：414.117 6。

化合物6b2：8-大黃素甲醚氧乙?；彼?，分子式C24H25NO8S，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.22 (s, 1H, H-8), 12.93 (s, 1H, H-20), 8.64 (d,J=7.0 Hz, 1H, NH), 7.60 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.76 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d,J=1.2 Hz, 1H, H- 4), 6.80 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.72 (dd,J=15.2, 2.8 Hz, 2H，H-17), 4.38 (p,J=7.2 Hz, 1H, H-19), 3.93 (d,J=20.4 Hz, 3H, H-15), 2.42 (d,J=17.6 Hz, 3H, H-16), 1.44 (dd,J=7.2, 1.6 Hz, 3H, H-21)；HRMS (M+),m/z：414.117 6。

化合物6c1：1-大黃素甲醚氧乙?；奖彼?，分子式C23H23NO8S，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.07 (s, 1H, H-20), 12.92 (s, 1H, H-8), 8.61 (d,J=8.0 Hz, 1H, NH), 7.51 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.34 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.22～7.19 (m, 4H, H-23, H-24, H-26, H-27), 7.17 (d,J=2.8 Hz, 1H, H-25), 7.15～7.10 (m, 1H, H- 4), 7.03 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.80 (s, 1H, H-17), 4.78～4.74 (m, 1H, H-17), 4.68 (q,J=7.6 Hz, 1H, H-19), 3.95 (d,J=18.4 Hz, 3H, H-15), 3.19～3.16 (m, 1H, H-21), 3.06 (dd,J=13.6, 7.6 Hz, 1H, H-21), 2.45 (d,J=14.8 Hz, 3H, H-16)；HRMS (M+),m/z：490.149 8。

化合物6c2：8-大黃素甲醚氧乙?；奖彼?，分子式C23H23NO8S，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.12 (s, 1H, H-8), 13.07 (s, 1H, H-20), 8.61 (d,J=8.0 Hz, 1H, NH), 7.69 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.17 (d,J=2.6 Hz, 1H, H-5), 7.22～7.19 (m, 4H, H-23, H-24, H-26, H-27), 7.17 (d,J=2.8 Hz, 1H, H-25), 7.15～7.10 (m, 1H, H- 4),6.87 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.80 (s, 1H, H-17), 4.78～4.74 (m, 1H, H-17), 4.68 (q,J=7.6 Hz, 1H, H-19), 3.95 (d,J=18.4 Hz, 3H, H-15), 3.19～3.16 (m, 1H, H-21), 3.06 (dd,J=13.6, 7.6 Hz, 1H, H-21), 2.45 (d,J=14.8 Hz, 3H, H-16)；HRMS (M+),m/z：490.149 8。

化合物6e1：1-大黃素甲醚氧乙?；涟彼幔肿邮紺24H25NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：12.93 (s, 1H, H-8), 12.87 (s, 1H, H-20), 8.46 (dd,J=7.6, 2.0 Hz, 1H, NH), 7.36 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.17 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d,J=1.6 Hz, 1H, H- 4), 6.90 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.68 (dq,J=17.2, 14.4 Hz, 2H, H-17), 4.37 (td,J=8.0, 5.6 Hz, 1H, H-19), 3.93 (s, 2H, H-15), 3.88 (s, 1H, H-15), 2.38 (d,J=16.4 Hz, 3H, H-16), 1.81 (tt,J=11.6, 5.6 Hz, 1H, H-22), 1.72 (t,J=7.6 Hz, 2H, H-21), 0.96 (dd,J=18.4, 6.4 Hz, 6H, H-23, H-24)；HRMS (M+),m/z：456.164 4。

化合物6e2：8-大黃素甲醚氧乙酰基亮氨酸，分子式C24H25NO8，黃色粉末。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：13.14 (s, 1H, H-8), 12.87 (s, 1H, H-20), 8.46 (dd,J=7.6, 2.0 Hz, 1H, NH), 7.51 (d,J=1.6 Hz, 1H, H-7), 7.29 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-5), 7.00 (d,J=1.6 Hz, 1H, H- 4), 6.75 (d,J=2.4 Hz, 1H, H-2), 4.68 (dq,J=17.2, 14.4 Hz, 2H, H-17), 4.37 (td,J=8.0, 5.6 Hz, 1H, H-19), 3.93 (s, 2H, H-15), 3.88 (s, 1H, H-15), 2.38 (d,J=16.4 Hz, 3H, H-16), 1.81 (tt,J=11.6, 5.6 Hz, 1H, H-22), 1.72 (t,J=7.6 Hz, 2H, H-21), 0.96 (dd,J=18.4, 6.4 Hz, 6H, H-23, H-24)；HRMS (M+),m/z：456.164 4。

在合成目標(biāo)化合物(5a～5i)和(6a～6h)時(shí)，通過核磁氫譜和高分辨基本確定為兩種同分異構(gòu)中的位置異構(gòu)體(見圖1)，大黃素甲醚上1,8號(hào)位上的羥基位置都可以發(fā)生成醚反應(yīng)，故所合成的尚未報(bào)道的新化合物都是異構(gòu)體。從目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR表征數(shù)據(jù)中可知，蒽醌上羥基的氫主要出現(xiàn)在δ13.00～13.40，酰胺基團(tuán)上的氫主要出現(xiàn)在δ8.50～8.90，蒽醌上的氫主要出現(xiàn)在化學(xué)位移δ6.63～7.90，蒽醌上甲氧基上的氫主要出現(xiàn)在δ3.80～4.10，蒽醌上甲基上的氫主要出現(xiàn)在δ2.40～2.55，且因?yàn)槭钱悩?gòu)體故存在積分不夠1的峰。

2.2 抑菌活性

在0.2 mmoL/L的濃度下，化合物的殺菌活性測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知：大多數(shù)目標(biāo)化合物對(duì)6種供試病原菌的抑菌活性均比對(duì)照藥劑效果好，其中化合物6e對(duì)水稻紋枯病菌和香樟炭疽病菌表現(xiàn)出中等偏上的活性，顯著高于其他19個(gè)異構(gòu)體的生物活性，且對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌和煙草赤星病菌都有一定的抑菌活性，但對(duì)于草莓灰霉病菌無明顯抑菌效果，本研究中并未發(fā)現(xiàn)有很高抑菌活性的化合物。初步構(gòu)效關(guān)系表明：該系列目標(biāo)化合物的殺菌活性較先導(dǎo)化合物有所提高，氨基酸結(jié)構(gòu)的引入增加了目標(biāo)化合物的殺菌活性[20]。大多數(shù)水解后化合物比其水解前氨基酸酯的殺菌效果更好，其中效果最好的是6e，但水解后含有2個(gè)羧酸的化合物殺菌效果一般。6b、6d、6e和6g的活性差異表明此類衍生物的抑菌活性與R1碳鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)有很大相關(guān)性，長(zhǎng)度為4個(gè)碳原子的異丁基時(shí)活性最佳。

表1 化合物在0.2 mmoL/L下的殺菌活性1)

1) —:表示活性均在10%以下poor activity is below 10%； 同列不同小寫字母表示不同產(chǎn)物在0.05水平存在顯著差異(p<0.05) different lowercase letters in the same column indicate that different products have significant differences at 0.05 level (p<0.05)

3 結(jié) 論

以溴乙酸乙酯為橋鏈，大黃素甲醚作為先導(dǎo)化合物，將氨基酸結(jié)構(gòu)引入到大黃素甲醚中得到系列的大黃素甲醚酰胺類化合物，所得大部分目標(biāo)化合物在濃度0.2 mmoL/L下均表現(xiàn)出比先導(dǎo)化合物大黃素甲醚更好的抑菌活性，但并沒有發(fā)現(xiàn)抑菌活性高的化合物。本研究通過初步構(gòu)效關(guān)系分析，為大黃素甲醚的結(jié)構(gòu)改造與修飾方向打下了一定的基礎(chǔ)。

輔助材料(Supporting Information)5c～5h、6b、6d、6f～6h的表征數(shù)據(jù)。這些材料可免費(fèi)從《林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)》網(wǎng)站(http:∥www.cifp.ac.cn)下載。