生態(tài)系統(tǒng)氮素運轉(zhuǎn)虛擬仿真實驗的設計與開發(fā)

何 磊，陳 欣，唐建軍，胡亮亮，程 磊

（1.浙江大學 國家級生物實驗教學示范中心，浙江 杭州 310058；2.浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058）

生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動是生態(tài)學研究的熱點和難點[1-6]，也是生態(tài)學課程教學的重點內(nèi)容[7-8]。為加深學生對生態(tài)系統(tǒng)中元素循環(huán)特征、運轉(zhuǎn)途徑等知識點的理解，我校生態(tài)學專業(yè)教學團隊開設了基于穩(wěn)定性同位素技術的生態(tài)系統(tǒng)氮素運轉(zhuǎn)實驗（以下簡稱“生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)實驗”）[9]，該實驗采用模擬自然生態(tài)系統(tǒng)和模型分析相結(jié)合的方式，定量跟蹤分析元素在生物之間的轉(zhuǎn)移過程和遷移率，有助于學生加深對生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)元素循環(huán)機制的理解。穩(wěn)定性同位素技術是研究生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)的重要手段，通過追蹤穩(wěn)定性同位素13C 和15N 可以精確分析其在遷移轉(zhuǎn)化中的變化規(guī)律[10-15]。我校生態(tài)學專業(yè)教學團隊開設的生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)實體實驗，即是采用穩(wěn)定性同位素15N 進行實驗測定。但是，穩(wěn)定性同位素技術應用于生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)實驗通常包括以下環(huán)節(jié)：①15N 標記物質(zhì)的制備。②15N 標記物質(zhì)在每個運轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)的回收。③回收的15N 標記物質(zhì)的研磨及樣品微量稱取。④樣品上機（同位素質(zhì)譜儀）分析。⑤計算。這些環(huán)節(jié)的實施面臨著時間長、費用高、儀器昂貴稀少等問題，實驗的開設受到時間、空間、儀器設備等的限制，只能小班進行，很難面向大量學生。

為解決時間、空間和儀器設備限制問題，進一步提高實驗受益人數(shù)，激發(fā)學生學習興趣，我校生命生態(tài)學教學團隊依托學科優(yōu)勢和科研實力[16-17]，設計開發(fā)出基于穩(wěn)定性同位素技術的生態(tài)系統(tǒng)氮素運轉(zhuǎn)虛擬仿真實驗系統(tǒng)。該系統(tǒng)不但突破了穩(wěn)定性同位素15N測定的時間和儀器限制，使學生能夠在短時間內(nèi)掌握利用穩(wěn)定同位素觀測元素循環(huán)轉(zhuǎn)移的原理和技術，而且很好地解決了時間與空間上的難題，有利于學生加強對生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)的認識與理解，系統(tǒng)掌握生態(tài)學知識與技能，提高創(chuàng)新能力。

1 生態(tài)系統(tǒng)氮素運轉(zhuǎn)虛擬仿真實驗原理

1.1 氮素在稻魚共生系統(tǒng)中的循環(huán)利用

稻魚共生系統(tǒng)中輸入的氮素（15N 標記的飼料氮）主要通過生物之間互補利用運轉(zhuǎn)，從而實現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)（圖1）。通過測定15N 標記的飼料氮在田魚、水稻植株、田間其他生物、土壤、水體的分布，即可計算15N 標記的飼料氮的運轉(zhuǎn)去向和循環(huán)利用效率。本虛擬仿真實驗利用3D、3DS MAX 系列信息技術，實現(xiàn)對標記15N 在稻魚共生系統(tǒng)中運轉(zhuǎn)過程的高度仿真。

圖1 稻魚共生系統(tǒng)氮素運轉(zhuǎn)循環(huán)示意圖

1.2 田魚個體取食行為差異與氮素利用

稻魚共生系統(tǒng)田魚的取食行為略有差異（圖2(a)），取食對象大致分為底棲動物、浮游植物、藻類3 類。個體取食行為的差異導致資源的充分利用，同位素生態(tài)位產(chǎn)生分離（圖2(b)）。本虛擬仿真實驗實現(xiàn)了對田魚的取食行為的高度仿真。

圖2 稻魚共生系統(tǒng)田魚的取食行為與資源利用

1.3 利用穩(wěn)定性同位素技術研究元素的利用與去向

具有相同質(zhì)子數(shù)和不同中子數(shù)的原子互稱為同位素，可分為放射性同位素和穩(wěn)定性同位素[18]。含有穩(wěn)定性同位素的分子與正常的分子相比，擁有相同的化學性質(zhì)，但由于質(zhì)量稍大，物理性質(zhì)有著一定的差異，因此在一些生物學過程中同位素的含量會發(fā)生變化，發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象。圖3 為穩(wěn)定性同位素技術應用原理。生態(tài)學研究中可以利用不同物體穩(wěn)定性同位素豐度的天然差異來研究食物鏈中生物的取食關系、動物食物來源等；也可以通過人為添加重同位素到目標物質(zhì)中，達到追蹤指示的作用。本虛擬仿真項目構建了利用穩(wěn)定性同位素測定氮素運轉(zhuǎn)的整套虛擬仿真實驗。

圖3 穩(wěn)定性同位素技術應用原理

2 實驗材料和設備

2.1 虛擬實驗材料

（1）稻魚共生系統(tǒng)虛擬材料：稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)野外場景虛擬；稻魚共生系統(tǒng)構建過程中水稻栽插和田魚放養(yǎng)的虛擬；水稻生長（苗期、分蘗期、幼穗分化期、抽穗揚花期、灌漿成熟期）和田魚生長過程虛擬。

（2）稻魚共生系統(tǒng)氮素15N 的運轉(zhuǎn)虛擬材料：虛擬稻魚共生系統(tǒng)氮素轉(zhuǎn)運過程，包括15N 標記的飼料的輸入、田魚活動的觀察、15N 在稻田的流向（如被水稻吸收、魚取食利用）等。

（3）15N 測定虛擬材料：虛擬野外場景中水稻、魚、土壤的取樣和室內(nèi)樣品前處理等。

2.2 虛擬實驗設備

（1）虛擬野外實驗裝置：樣方、魚活動觀測攝像設備和系統(tǒng)、穩(wěn)定性同位素標記設備、土壤采集工具。

（2）虛擬實驗室儀器設備：電子天平、烘箱、行星式球磨儀、研磨機、超低溫干燥箱、同位素質(zhì)譜儀等實驗儀器。

3 實驗系統(tǒng)教學設計

本虛擬仿真實驗系統(tǒng)以我校生命科學學院野外科研基地、全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)——浙江青田稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)為原型，制作了高度仿真的稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)，并設計了一套完整模擬生態(tài)系統(tǒng)中物種間氮素運轉(zhuǎn)過程的實驗。該系統(tǒng)實驗部分由稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)的構建、稻魚生態(tài)系統(tǒng)氮素隨飼料的輸入、田魚活動的觀察、水稻田魚土壤的取樣和樣品前處理、穩(wěn)定性同位素的測定與計算、稻魚共生系統(tǒng)氮素利用分析6 個模塊組成，采用學習和考核2 種模式（圖4）。

圖4 2 種實驗模式及6 大模塊

3.1 稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)的構建

該模塊介紹了稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)的基本情況，包括該系統(tǒng)的歷史、地形地貌、周邊環(huán)境及相關科學研究進展等。為了讓學生更好地了解實驗相關知識，進入實驗模塊之前，學生需要完成相關題目（圖5(a)）。隨后學生進入虛擬野外場景，選擇實驗工具，根據(jù)實驗提示，按照參數(shù)（密度、規(guī)格）進行水稻種植以及青田田魚放養(yǎng)（圖5(b)），構建稻魚共生系統(tǒng)、水稻單作系統(tǒng)和田魚單養(yǎng)系統(tǒng)（圖5(c)）。

3.2 稻魚生態(tài)系統(tǒng)氮素隨飼料的輸入

該模塊中學生需要選擇15N 標記的飼料并進行投喂，從而了解氮素輸入生態(tài)系統(tǒng)的方式及過程。在該過程中學生需要根據(jù)田魚大小計算投喂量并在正確的時間進行投喂，同時計算出該時期投喂的飼料中氮素含量（圖6）。通過這一過程，強化了學生對于氮素在生態(tài)系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化的理解，讓元素在生態(tài)系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化變得更加形象和具體。

圖6 15N 標記飼料的投放

3.3 田魚活動的觀察

該模塊中學生需要對比稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)和田魚單養(yǎng)系統(tǒng)中魚的活動情況。首先，學生將在兩個系統(tǒng)小區(qū)中建立樣方，并在各個樣方邊架立攝像機對樣方進行錄像并收集儲存錄像（圖7(a)），然后根據(jù)錄像來觀察田魚的活動并提取數(shù)據(jù)（圖7(b)）。學生通過提取數(shù)據(jù)進行分布多樣性及分布均勻性指數(shù)的計算，從而了解不同時間段內(nèi)田魚在田間活動分布格局（圖7(c)）。

3.4 水稻、田魚、土壤的取樣和樣品前處理

該模塊中學生在野外場景中對3 種樣品進行取樣，并將取到的樣品帶回實驗室進行樣品的前處理。

（1）水稻樣品。水稻取樣需從每株水稻的土表處剪斷，用自來水沖去表面附著物，105 ℃殺青處理15 min，然后65 ℃烘干至恒重。每株水稻稱量記錄干 重后剪成長度約為1 cm 的碎片并混合均勻，最后取適量樣品研磨后保存在塑封袋中備用（圖8(a)）。

圖7 田魚活動的觀察模塊

（2）動物樣品。水稻收獲后，收取所有動物樣品。系統(tǒng)中收獲的魚均暫養(yǎng)于清水中24 h 排凈腸道內(nèi)容物，隨后轉(zhuǎn)入–80 ℃冰箱保存，真空冷凍干燥。以每個小區(qū)為單位稱量記錄干重后剪碎混合均勻，然后取適量研磨后保存在塑封袋中備用（圖8(b)）。

（3）土壤樣品。在水稻插秧之前和動物收取之后，分別對每個小區(qū)表層土（10 cm）進行5 點取樣，混合均勻，風干后碾壓磨細過100 目篩，保存在塑封袋中備用（圖8(c)）。

圖8 水稻、田魚、土壤的取樣和樣品前處理模塊

3.5 穩(wěn)定性同位素的測定與計算

該模塊中學生對處理好的土壤、田魚和水稻等樣品進行微量稱量、包樣及上機測定等操作，掌握同位素樣品的檢測及分析。

（1）樣品稱重及包埋（微量）。學生在虛擬環(huán)境中左手戴一次性CPE 手套（接觸樣品），利用超微量天子天平（METTLER TOLEDO XP6）對樣品進行稱量，稱好的樣品放入直徑4 mm、高6 mm 的錫紙杯中進行包埋并記錄樣品質(zhì)量（圖9(a)）。

（2）上機測定。同位素質(zhì)譜儀（美國，Thermo Fisher Delta V Advantage）提前預熱、檢測，打開所需氣體，測定參照的標準樣品。將樣品編號和質(zhì)量錄入軟件中，選擇測定分析方法，同時將樣品按順序加入自動進樣器進行測定（圖9(b)）。

（3）計算。樣品中15N 含量計算公式見式（1）[19]，其中數(shù)據(jù)由同位素質(zhì)譜儀直接測得。

其中，w(N)為樣品總氮含量，R為樣品的重同位素（15N）與輕同位素（14N）的豐度比。

圖9 穩(wěn)定性同位素的測定與計算模塊

3.6 稻魚共生系統(tǒng)氮素利用分析

該模塊學生將測定的結(jié)果代入相應的公式，計算出稻魚共生系統(tǒng)中氮素在各個生物體中的含量，分析氮素在稻魚共生生態(tài)系統(tǒng)的遷移規(guī)律（圖 10(a)）。同時，根據(jù)數(shù)值完成稻魚系統(tǒng)中氮素遷移的模式圖（圖10(b)）。計算公式如下[20]：

式中：a為水稻吸收的環(huán)境中的N 對水稻地上部分總N 量的貢獻率；b為飼料N 對水稻地上部分總N 量的貢獻率；δRM(15N)為水稻單作處理下水稻的15N 同位素千分差值；δfeed(15N)為15N 標記飼料的15N 同位素千分差值；δRFS(15N)為水稻和水產(chǎn)動物共作處理下水稻的同位素千分差值。

圖10 稻魚共生系統(tǒng)氮素利用分析模塊

4 虛擬仿真實驗系統(tǒng)操作流程

（1）學生進入虛擬仿真系統(tǒng)，根據(jù)教師講解及視頻學習了解實驗目的、實驗原理，熟悉和鞏固相關概念，隨后進入虛擬實驗場景，了解整個虛擬仿真實驗包含的內(nèi)容及模塊。

（2）項目中設計了一個教師的角色，學生進入實驗場景后，通過教師的指導與提示，進行虛擬實驗的操作。通過學習模式的虛擬實驗場景使學生了解稻魚生態(tài)系統(tǒng)概貌、水稻生長不同階段、田魚取食活動等內(nèi)容；通過相關實驗過程使學生掌握水稻種植密度和規(guī)格、魚取食行為、水稻、魚和土壤樣品前處理、穩(wěn)定性同位素氮的測定以及稻魚共生系統(tǒng)氮素利用分析等。

（3）學生進入考核模式進行完整實驗，完成相關習題，平臺自動記錄學生提交的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

（4）學生從平臺下載數(shù)據(jù)，并進行統(tǒng)計分析，撰寫報告并提交。

（5）教師根據(jù)學生提交的原始數(shù)據(jù)和實驗報告給出成績。

5 結(jié)語

本虛擬仿真實驗系統(tǒng)以稻魚共生系統(tǒng)氮素遷移定量跟蹤的實體實驗為基礎，融合了科研項目的研究成果，增加了稻魚生態(tài)系統(tǒng)的構建、田魚取食活動觀察及氮素走向過程觀察等方面的實驗內(nèi)容，促進了科研與教學的有機融合，拓寬了本科實驗教學的深度和廣度。此外，該虛擬仿真系統(tǒng)充分利用信息化技術，打破課堂與實踐壁壘，將課堂上晦澀難懂的概念、難以一次性觀察到的現(xiàn)象與野外實際相結(jié)合，以虛補實，為實體實驗教學提供了虛擬素材，鞏固了實體教學?！疤搶嵔Y(jié)合、以虛促實”的教學方式激發(fā)了學生探索大自然的激情，提高了學生的學習效率和創(chuàng)新能力。