海南省新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥發(fā)生情況及基因突變分析研究

趙振東，王潔

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是一種G6PD基因突變引起的X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性酶缺陷疾病，該病是引起蠶豆病、感染性溶血、藥物性溶血以及新生兒高膽紅素血癥等的重要原因，全球約4億人口罹患此病[1]。目前已發(fā)現(xiàn)G6PD基因有400多個(gè)基因突變類型[2]，而我國(guó)已檢出25種，且多分布在外顯子區(qū)[3]。G6PD缺乏癥在我國(guó)南方地區(qū)發(fā)病率高，尤以廣東、廣西以及海南地區(qū)發(fā)病率最高[4]。迄今為止未見(jiàn)海南省全省人群大規(guī)模G6PD基因調(diào)查分析，故本研究選取2017年出生的全海南省新生兒進(jìn)行G6PD基因篩查，分析海南省新生兒G6PD基因突變類型及其分布特點(diǎn)，旨在為優(yōu)生優(yōu)育提供科學(xué)依據(jù)。

本研究?jī)r(jià)值：

（1）全球約4億人口罹患葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥。據(jù)報(bào)道已發(fā)現(xiàn)400多個(gè)基因突變，而我國(guó)已報(bào)道25種突變類型，除IVS-5 636/637T del、IVS-5 C134T和IVS11 93T＞C（SNP）在內(nèi)含子區(qū)外，余者分布在外顯子區(qū)。雖然平素可無(wú)任何癥狀，如遇誘因可引發(fā)急性溶血性貧血而導(dǎo)致死亡，目前尚無(wú)有效的根治措施，該病在海南省高發(fā)，因此在海南省開(kāi)展新生兒大規(guī)模的G6PD缺乏癥篩查和基因診斷，做到早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防顯得尤為重要。

（2）趙振東等研究結(jié)果顯示，海南省新生兒G6PD缺乏癥發(fā)生率較高，且基因突變類型豐富，特別是海南省特有少數(shù)民族——黎族的G6PD缺乏癥發(fā)生率顯著高于漢族。同時(shí)，G6PD缺乏癥基因突變類型以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 和 c.1024C＞T 為主；且發(fā)現(xiàn) 5例未知突變，其中 c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，屬于海南省人群的首次報(bào)道。該結(jié)論有利于G6PD缺乏癥的防治，為后續(xù)基因突變導(dǎo)致的不同臨床表型研究奠定了分子基礎(chǔ)。

本研究局限性：

受限于檢測(cè)樣本量以及相關(guān)經(jīng)費(fèi)等一些原因，目前只檢測(cè)了2017年的樣本，另外受限于患者意愿等因素還有2例未知突變未能抽血進(jìn)行基因測(cè)序。另外限于熔解曲線法檢測(cè)探針覆蓋序列變異范圍，本研究只報(bào)道了檢測(cè)到16種中國(guó)人群常見(jiàn)變異位點(diǎn)中10種變異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取全海南省內(nèi)各助產(chǎn)單位2017-01-01至2017-12-31出生的活產(chǎn)新生兒130 512例，其中男71 531例，女58 981例。依據(jù)《新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)專家共識(shí)》[5]（簡(jiǎn)稱：G6PD專家共識(shí)）指出的G6PD篩查要求，以出生滿72 h并充分哺乳8次以上為納入標(biāo)準(zhǔn)。采集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的新生兒的足跟血制成濾紙干血片，用于G6PD基因初篩。抽取初篩可疑樣本2 ml靜脈血于EDTA-K2抗凝管，用WHO推薦的G6PD/6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6GPD）比值法進(jìn)行生化檢查確診。生化檢查確診為G6PD缺乏癥的患兒，找出其干血片進(jìn)行基因分型。檢驗(yàn)前進(jìn)行樣本的質(zhì)量控制：（1）初篩干血片質(zhì)量控制：水平晾干后密封于封口袋內(nèi)，3 d內(nèi)通過(guò)新生兒疾病篩查標(biāo)本冷鏈物流服務(wù)項(xiàng)目運(yùn)送至海南省新生兒篩查中心實(shí)驗(yàn)室立即檢測(cè)，未能立即檢測(cè)的樣本于-20 ℃冷柜保存；（2）生化檢查確診抗凝血樣本質(zhì)量控制：定期召回初篩可疑病例，采集其靜脈血置于EDTA-K2抗凝管中，搖勻，立即送檢，當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)。

本研究經(jīng)海南省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)〔海南省婦幼保健院（2018）倫審第（37）號(hào)〕，患兒家長(zhǎng)均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器 全自動(dòng)熒光免疫分析儀（2021GSP）、自動(dòng)打孔儀（2081Panthera-PuncherTM9）、日立7060生化儀、ABSON MicBio-IV型孵育振蕩器、核酸提取儀（Lab-AidTM 824）及伯樂(lè)Bio-Rad CFX96型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀。

1.2.2 試劑 珀金埃爾默股份有限公司G6PD測(cè)定試劑盒、廣州米基科技發(fā)展有限公司G6PD/6GPD試劑盒、廈門(mén)致善生物科技股份有限公司Lab-Aid核酸提取Micro試劑盒和G6PD熒光PCR熔解曲線法基因突變檢測(cè)試劑盒（可檢測(cè)中國(guó)人常見(jiàn)的16種G6PD基因突變類 型：c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.383T＞C、c.95A＞G、c.1387C＞T、c.392G＞T、c.1360C＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1381G＞A、c.493A＞G、c.519C＞T）。

1.2.3 試驗(yàn)方法

1.2.3.1 G6PD基因篩查試驗(yàn) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用G6PD測(cè)定試劑盒，即GSP熒光分析法對(duì)新生兒干血片上GSP進(jìn)行初篩。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)量值≤2.6 U/dl為G6PD基因初篩陽(yáng)性。

1.2.3.2 G6PD生化檢查確診試驗(yàn) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用G6PD/6GPD試劑盒，即日立7060生化儀對(duì)召回可疑病例進(jìn)行生化檢查確診。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：G6PD/6GPD＜1為G6PD缺乏癥。

1.2.3.3 G6PD基因突變檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盆說(shuō)明書(shū)操作，找出確診為G6PD缺乏癥患兒的濾紙干血片，使用核酸提取儀Lab-Aid824提取干血片樣本中基因組DNA。然后用帶有FAM、HEX、ROX和Cy5檢測(cè)通道且具有熔解曲線分析功能的Bio-Rad CFX96型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增和熔解曲線分析。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)判斷是否發(fā)生突變及突變類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩、確診情況 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩樣本中初篩陽(yáng)性率為4.00%（5 221/130 512），G6PD/6GPD確診2 993例，經(jīng)基因檢測(cè)該2 993例新生兒均有G6PD基因突變。海南省新生兒G6PD/6GPD確診G6PD缺乏癥發(fā)生率和G6PD基因突變率均為2.29%（2 993/130 512）（見(jiàn)表1）。

G6PD/6GPD確診G6PD缺乏癥發(fā)生率漢族為1.80%（1 972/109 590）， 黎 族 為 5.28%（934/17 698），其他民族為2.70%（87/3 224）。黎族G6PD缺乏癥發(fā)生率高于漢族，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=826.206，P＜0.001）。

表1 2017年度海南省全省新生兒G6PD缺乏癥初篩情況及G6PD/6GPD確診人數(shù)Table 1 The first screening of neonatal G6PD deficiency and the number of G6PD/6GPD diagnosis in Hainan Province in 2017

2.2 2017年度海南省全省G6PD缺乏癥新生兒基因突變類型 本次共檢出10種基因突變類型：1 636例（54.66%）c.1376G＞T，659 例（22.02%）c.1388G＞A，254例（8.49%）c.95A＞G，204例（6.82%）c.1024C＞T，93 例（3.11%）c.871G＞A，64例（2.14%）c.519C＞T，25例（0.84%）c.392G＞T，22例（0.74%）c.1360C＞T，19例（0.63%）517T＞C，11例（0.37%）c.592C＞T，并檢出8例（0.27%）c.1376G＞T復(fù)合c.1388G＞A突變，3例（0.10%）c.1376G＞T復(fù) 合 c.871G＞A突 變，3例（0.10%）c.1376G＞T復(fù)合c.517T＞C突變。并發(fā)現(xiàn)5例（0.17%）未知突變，目前有3例經(jīng)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)1例為 487G＞A、1例為 1004C＞A 和 1例為 c.86C＞T，另 2例因家屬和經(jīng)費(fèi)等原因未做測(cè)序檢測(cè)。

3 討論

G6PD缺乏癥是多民族的遺傳性疾病，是世界上最常見(jiàn)的酶缺乏癥[6]，WHO將其劃分為Ⅰ～Ⅴ共5個(gè)類別[7]，絕大多數(shù)缺陷個(gè)體屬重度缺陷（Ⅱ和Ⅲ類），雖然平素可無(wú)任何癥狀[8]，但是由于G6PD缺乏，紅細(xì)胞更容易受到食物和藥物引起的氧化應(yīng)激的損傷，導(dǎo)致急性溶血性貧血[9]，若不能制止溶血和及時(shí)輸血，可發(fā)生死亡[10]。目前G6PD缺乏癥尚無(wú)有效的根治措施，但該病在中國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)較為普遍，特別是海南省屬該病的高發(fā)地區(qū)[11]。因此在海南省新生兒期開(kāi)展大規(guī)模的篩查和基因診斷，做到早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防顯得尤為重要。

目前臨床上使用的G6PD基因檢測(cè)方法有等位基因特異性擴(kuò)增、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)及基因測(cè)序技術(shù)、等位基因寡核苷酸探針雜交等[12]，但是以上方法受到操作高要求、試劑成本、儀器設(shè)備等因素的限制，而多色探針熒光PCR熔解曲線法是近年來(lái)興起的一種G6PD基因檢測(cè)手段，是2019年新發(fā)布的G6PD專家共識(shí)[5]推薦的基因檢測(cè)方法，該方法涵蓋了98.5%的中國(guó)人群常見(jiàn)的10種基因突變類型，又包含了6種較為少見(jiàn)的基因突變類型，在判斷基因位點(diǎn)突變的同時(shí)，因其標(biāo)記不同顏色的生物素探針，可直接在PCR儀上分析結(jié)果，且試劑成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)[13]，已逐漸應(yīng)用于臨床檢測(cè)當(dāng)中，這也是本研究選用此方法的原因所在。

本研究統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，2017年度海南省全省新生兒G6PD基因突變以占54.66%的c.1376G＞T和占22.02%的c.1388G＞A為主，兩者合占總突變的76.68%，其余基因型均不足10%，這是中國(guó)人群最常見(jiàn)的G6PD基因突變基因型[14]。并且c.95A＞G和c.1024C＞T分別占總突變類型的8.49%、6.82%，說(shuō)明這兩種也較為常見(jiàn)。2017年度海南省出生的新生兒可以視為海南省人口的代表，以上4種基因突變占總突變的91.99%，可以認(rèn)為這是海南省人群G6PD基因突變的主要類別。本次共檢出10種基因突變類型，相較于其他研究[15-16]G6PD基因突變類型豐富。G6PD/6GPD確診的2 993例G6PD缺乏癥新生兒經(jīng)基因檢測(cè)均有突變，海南省人群G6PD基因突變率約為2.29%，漢族為1.80%，黎族為5.28%，其他民族為2.70%。漢族和黎族G6PD基因突變有差異，黎族人群G6PD缺乏癥發(fā)生率顯著高于漢族，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明了G6PD基因突變不但具有地域差異而且也有種族特點(diǎn)[17-18]。筆者認(rèn)為海南省人群G6PD基因突變率會(huì)更高，原因如下：首先G6PD/6GPD對(duì)于女性雜合子的低檢出率，必然會(huì)造成女性雜合子的漏檢。另外地中海貧血患者會(huì)影響G6PD 活性增高已達(dá)成共識(shí)[19-20]，這必然使得GSP熒光分析法對(duì)新生兒G6PD的初篩受到影響，造成部分G6PD雜合子的漏檢，這也直接影響G6PD基因突變的檢出率。而海南省恰恰是地中海貧血高發(fā)地區(qū)，特別是黎族發(fā)病率更高[21]，由此推算海南省黎族新生兒G6PD基因突變率會(huì)高于本次得到的5.28%。G6PD基因全長(zhǎng)20 kb，共編碼515個(gè)氨基酸[22]，從而導(dǎo)致突變的復(fù)雜性。本研究發(fā)現(xiàn)3種復(fù)合突變也證實(shí)了這一點(diǎn)：8例c.1376G＞T復(fù)合c.1388G＞A；3例c.1376G＞T復(fù)合c.871G＞A突變；3例c.1376G＞T復(fù)合c.517T＞C突變。PCR熔解曲線法可以檢測(cè)探針覆蓋區(qū)域的序列變異，因此本研究先后檢出了5例未知位點(diǎn)突變，其中3例經(jīng)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，各占總突變的0.03%，這3例基因突變類型在海南還未見(jiàn)報(bào)道。另外2例未知突變，限于家屬和經(jīng)費(fèi)等原因還未做測(cè)序。

綜上所述，海南省新生兒G6PD缺乏癥發(fā)生率較高，且基因突變類型豐富，特別是海南省特有少數(shù)民族——黎族的G6PD缺乏癥發(fā)生率顯著高于漢族。同時(shí)，G6PD缺乏癥基因突變類型主要以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.1024C＞T為主；且發(fā)現(xiàn)5例未知突變，其中c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突變各有1例，屬于海南省人群的首次報(bào)道。該結(jié)論有利于G6PD缺乏癥的防治，為后續(xù)基因突變導(dǎo)致的不同臨床表型研究奠定分子基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：趙振東進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、論文修訂，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；趙振東、王潔進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、結(jié)果分析與解釋，撰寫(xiě)論文；王潔負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。