Tat結(jié)合蛋白30在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系研究

劉慶偉，李勇，檀碧波，范立僑，趙群，李兆星，楊沛剛

胃癌是全球第二大常見惡性腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差的特點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的侵襲性與抑癌基因的突變密切相關(guān)[1]。Tat結(jié)合蛋白30（TIP30）是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、修復(fù)損傷DNA、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞葡萄糖耐量、抑制核轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[2-4]。TIP30在多種腫瘤組織中處于缺失或低表達(dá)狀態(tài)，并且其低表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[5-6]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）可通過(guò)分解基底膜膠原蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于TIP30與胃癌相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道，本研究旨通過(guò)檢驗(yàn)TIP30、MMP-9在腫瘤組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性，探討TIP30與胃癌臨床病理特征、腫瘤侵襲間的關(guān)系，及其對(duì)患者預(yù)后的影響。

本研究?jī)r(jià)值：

（1）胃癌的侵襲性與多種抑癌基因的突變及其異常有關(guān)，Tat結(jié)合蛋白30（TIP30）是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子，其具有多種功能，包括致瘤抑制、凋亡誘導(dǎo)和降低血管生成特性，但其是否改變胃癌患者預(yù)后以及與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未得到研究證實(shí)。

（2）劉慶偉等研究結(jié)果初步表明TIP30是胃癌患者的一個(gè)重要預(yù)后因子，且TIP30可能是一種潛在的抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，為今后的體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)的開展提供了方向。

1 資料與方法

1.1 研究標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有完整的臨床病歷資料，并經(jīng)病理診斷確診；（2）均行根治性胃切除術(shù)聯(lián)合D2淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前未接受過(guò)放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）術(shù)中探查有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）姑息性手術(shù)切除原發(fā)病灶；（4）殘胃癌患者。

1.2 一般資料 收集2012年5月—2013年2月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的106例胃癌患者的腫瘤組織石蠟標(biāo)本，患者中男82例，女24例；平均年齡56（27，76）歲；腫瘤直徑：＜5 cm 45例，≥5 cm 61例；浸潤(rùn)深度：T1～T239例，T3～T467例；分化程度：中/高分化65例，低分化41例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期70例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。

另選取2017年就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行胃鏡活檢的30例胃潰瘍患者，取其正常胃黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷為淺表胃炎、十二指腸炎者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者胃黏膜組織病理檢查結(jié)果為胃黏膜重度不典型增生。

上述標(biāo)本采集均征得患者本人同意，本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.3 采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織和正常胃黏膜組織TIP30、MMP-9表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟、乙醇脫水；加3% H2O237 ℃下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次×3 min；行抗原修復(fù)，山羊血清孵育，加TIP30抗體（1∶200）、MMP-9抗體（1∶200），4 ℃下孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次×5 min；加生物素標(biāo)記，37 ℃下孵育20 min；PBS沖洗3次×5 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，37 ℃下孵育30 min；PBS沖洗3次×5 min；加新配制的DAB顯色液，陽(yáng)性顯色為棕黃色；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水、透明，封固。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：由2位高年資經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師指導(dǎo)收集病理標(biāo)本和閱片，TIP30、MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)均定位于胞質(zhì)，結(jié)果按半定量積分法判斷，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。不著色為0分，基本不著色（淡黃色）為1分，中等著色（棕黃色）為2分，強(qiáng)著色（棕褐色）為3分。著色細(xì)胞面積按陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比判斷：陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比≤5%為0分，6%～24%為1分，25%～49%為2分，≥50%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4 分為（++），5～6分為（+++）；（+）～（+++）均表示陽(yáng)性。

1.4 隨訪情況 隨訪截至2018-02-28。共隨訪3～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間35個(gè)月，采取電話、門診復(fù)查方式隨訪，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者均經(jīng)影像學(xué)檢查及病理學(xué)檢查證實(shí)。生存期的計(jì)算從手術(shù)日期到由復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止，或到隨訪截止日期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者的生存曲線，通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線的差異性；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析患者的預(yù)后因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIP30在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況 TIP30在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為41.5%（44/106），低于正常胃黏膜組織的86.7%（26/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.089，P＜0.001，見圖1）。

2.2 不同臨床特征患者腫瘤組織TIP30表達(dá)情況比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者腫瘤組織中TIP30表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期患者腫瘤組織中TIP30表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 MMP-9在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況 MMP-9在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為82.1%（87/106），高于正常胃黏膜組織的23.3%（7/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.800，P＜0.001，見圖2）。

2.4 不同臨床特征患者腫瘤組織中MMP-9表達(dá)情況比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者腫瘤組織中MMP-9表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期患者腫瘤組織中MMP-9表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 腫瘤組織中TIP30、MMP-9表達(dá)情況的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，腫瘤組織中TIP30、MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.405，P＜0.001）。

2.6 不同TIP30表達(dá)情況的胃癌患者生存情況比較TIP30陽(yáng)性表達(dá)的胃癌患者中位生存時(shí)間為45個(gè)月，TIP30陰性表達(dá)的胃癌患者中位生存時(shí)間為23個(gè)月；不同TIP30表達(dá)情況的胃癌患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.025，P=0.003，見圖3）。

圖1 TIP30在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）Figure 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer tissue and normal gastric mucosal tissues

表1 不同臨床特征患者腫瘤組織TIP30表達(dá)情況比較〔n（%）〕Table 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer patients by different clinical features

圖2 MMP-9在腫瘤組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）Figure 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa tissues

表2 不同臨床特征患者腫瘤組織中MMP-9表達(dá)情況比較〔n（%）〕Table 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer patients by different clinical features

2.7 胃癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析 以患者預(yù)后情況（賦值：生存=0，死亡=1）為因變量，以性別（賦值：女=0，男=1）、年齡（賦值：＜60歲=0，≥60歲=1）、腫瘤直徑（賦值：＜5 cm=0，≥5 cm=1）、分化程度（賦值：中/高分化=0，低分化=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（賦值：有=1，無(wú)=0）、TNM分期（賦值：Ⅰ+Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、TIP30表達(dá)情況（賦值：陽(yáng)性=1，陰性=0）為自變量，進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況〔HR=2.842，95%CI（1.597，5.057）〕、TIP30表達(dá)情況〔HR=0.517，95%CI（0.299，0.895）〕是胃癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05，見表3）。

3 討論

胃癌根治性手術(shù)是改善患者預(yù)后最有效的手段，但50%～60%接受根治性手術(shù)切除的患者如T3/T4期的患者，其術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅為30%左右[7]。然而臨床上常有處于同一腫瘤分期的胃癌患者預(yù)后不同，因此有必要尋找影響其預(yù)后的因素，從而使胃癌治療的療效最大化。

圖3 不同TIP30表達(dá)情況的胃癌患者生存曲線Figure 3 Survive curve of gastric cancer patients by the expression level of TIP30

表3 胃癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Table 3 Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors for gastric cancer patients

TIP30是新發(fā)現(xiàn)的一種30 kD的Tat結(jié)合蛋白，TIP30基因又稱CC3或HTATIP2，是1997年發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的基因[8]。TIP30基因具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡及血管形成等作用，并且在多種腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)表達(dá)異常。CHEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中TIP30表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（46.7%比79.0%），TIP30表達(dá)水平也與其腫瘤分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切向關(guān)。LIU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TIP30在膽囊腺癌中低表達(dá)，且與低分化、腫瘤腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腺癌浸潤(rùn)程度密切相關(guān)。黃奇迪等[11]通過(guò)免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，TIP30在乳腺癌組織中的表達(dá)情況與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）和分子分型相關(guān)，其蛋白表達(dá)缺失可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移，是乳腺癌患者預(yù)后的影響因素。樊麗偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TIP30在結(jié)直腸腺瘤與結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯低于正常結(jié)直腸黏膜組織，TIP30表達(dá)水平隨著腺瘤絨毛成分及惡變率的增加而逐漸降低。本研究免疫組化法結(jié)果顯示，TIP30在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常胃黏膜組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期與腫瘤組織中TIP30表達(dá)情況有關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，TIP30與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，楊普等[13]研究結(jié)果顯示腫瘤組織中TIP30低表達(dá)的程度與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)性，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和體外侵襲能力可通過(guò)TIP30基因過(guò)表達(dá)被抑制[14]。通過(guò)抑制TIP30基因表達(dá)而增強(qiáng)EMT基因的表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[15]。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）可以進(jìn)一步降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分，分解侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后中起關(guān)鍵作用。而MMP-9為MMPs中重要的一員，通過(guò)分解基底膜膠原蛋白從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[16]。GUO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TIP30在胰腺癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)；在抑制TIP30表達(dá)后發(fā)現(xiàn)SW1990細(xì)胞MMP-9的表達(dá)上調(diào)、SW1990細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，MMP-9在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織，不同浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期與腫瘤組織中MMP-9表達(dá)情況有關(guān)；分析TIP30、MMP-9在腫瘤組織中的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者存在明顯的負(fù)相關(guān)性，提示TIP30可能通過(guò)調(diào)控MMP-9促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。生存分析結(jié)果顯示，不同TIP30表達(dá)情況的胃癌患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TIP30表達(dá)情況是胃癌患者預(yù)后的影響因素，表明TIP30表達(dá)陽(yáng)性、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者預(yù)后較好，生存期明顯延長(zhǎng)。

綜上所述，TIP30在胃癌腫瘤組織中低表達(dá)，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時(shí)是患者預(yù)后的影響因素。但本研究尚存在一定的不足之處，例如TNM分期是目前公認(rèn)的重要的預(yù)后因素，其在本研究結(jié)果中并未得到陽(yáng)性結(jié)果，可能與Ⅰ、Ⅱ期樣本量少有關(guān)，有待于今后更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：劉慶偉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫論文；李勇進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；檀碧波、范立僑、趙群負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；李兆星、楊沛剛負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理，進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析。

本文無(wú)利益沖突。