EAMG大鼠動物模型腎上腺免疫相關(guān)性研究

王 靜，方麗潔，劉 穎，姜 雄, 況時(shí)祥

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)介導(dǎo)的、細(xì)胞免疫依賴的、補(bǔ)體參與的、神經(jīng)-肌肉接頭傳遞功能障礙的、獲得性自身免疫性疾病。該病在世界范圍內(nèi)的年發(fā)病率為8～20/10萬，我國為0.5～2.5/10萬，且呈漸進(jìn)性升高趨勢，初步估計(jì)，我國目前有重癥肌無力患者60萬人。MG病情易于反復(fù)，遷延難愈，嚴(yán)重者可累及呼吸肌而危及生命。腎上腺皮質(zhì)激素是治療MG的有效手段。近年來興起的神經(jīng)免疫內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)軸是腦調(diào)控免疫系統(tǒng)的主要傳出通路。HPA軸通過分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子作用于免疫細(xì)胞上的相應(yīng)受體及細(xì)胞因子。推測內(nèi)分泌系統(tǒng)腎上腺皮質(zhì)的功能失調(diào)或許在MG的發(fā)病與復(fù)發(fā)的機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，而針對腎上腺細(xì)胞因子的干預(yù)或許能夠在MG的治療上有所突破。我們前期的研究表明，EAMG(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素CRH mRNA(corticotrpin releasing Hormone,CRH)表達(dá)明顯異常，且HPA軸的損傷與EAMG發(fā)病有密切聯(lián)系[1]。為了進(jìn)一步探究MG發(fā)病內(nèi)分泌相關(guān)免疫機(jī)制，本研究擬用Lewis大鼠與EAMG大鼠經(jīng)典模型比較，并通過各組大鼠腎上腺中免疫相關(guān)性細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)異常，如干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)等以期闡明其發(fā)病機(jī)制中的部分環(huán)節(jié)，為尋找MG治療的作用新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Lewis大鼠36只，雌性，6～8 w齡，體重100～150 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001，檢疫后送貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑 鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(R97-116)，Sigma公司；完全福氏佐劑(CFA)，Sigma公司；不完全福氏佐劑(IFA)，Sigma公司；強(qiáng)的松片(規(guī)格5 mg/片)(國藥準(zhǔn)字H33021027)，浙江仙琚制藥股份；大鼠AchR-AbElisa測定試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司(批號：E02A0203)；動物組織總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；PrimescriptTM RTreagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，引物設(shè)計(jì)，大連寶生物工程有限公司；Golview Ⅱ核酸染料，北京索萊寶科技有限公司；6×DNA Loading Buffer、DNA Marker，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；單抗3G10和1F3武漢博士德生物工程有限公司；HRP反應(yīng)底物OPD Amerseco公司；ELISA封閉液(1%BSA)，福州邁新生物技術(shù)有限公司；兔多克隆抗體(IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗原抗體稀釋液(0.01 mol PBS，pH 7.4) ，福州邁新生物技術(shù)有限公司；蘇木素、乙醇伊紅，福州邁新生物技術(shù)有限公司；中性樹膠，北京索寶來科技有限公司。

1.3 主要設(shè)備儀器 Σ960型全自動酶標(biāo)儀，美國Metertech公司；T-500型電子天平，美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司；GS-15R 低溫高速離心機(jī)，美國Beckman公司； HJ-2 二聯(lián)磁力加熱攪拌器，金壇市億通電子有限公司；玻璃勻漿器，海門市三和建華玻塑儀器廠；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；Thermo NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)，美國賽默飛公司；7500Real Time PCR system，美國賽默飛公司；Eio-rad T100PCR儀，美國賽默飛公司；SIM凝膠成像分析系統(tǒng)，美國GOLD-SIM公司；光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康SPF級雌性Lewis大鼠36只，隨機(jī)選取24只大鼠進(jìn)行EAMG造模，另外12只作為對照組，將確定造模成功的大鼠再隨機(jī)分為兩組，每組各12只，分別為模型組、強(qiáng)的松組。造模成功2 w后各組分別予以灌胃治療，模型組及對照組(等體積生理鹽水)、強(qiáng)的松組(強(qiáng)的松5.4 mg/kg)，大鼠灌胃給藥體積為10 ml/kg，每日一次，連續(xù)4 w。

2.2 實(shí)驗(yàn)造模 首先將鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(R97-116)、完全福氏佐劑(CFA)、磷酸緩沖液(PBS)三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑；首次免疫：取乳劑200 μl(含R97-116：100 μg)于造模鼠足墊、腹部、背部多點(diǎn)皮下注射，對照組皮下注射等量PBS；首次免疫后30 d及45 d，將R97-116、不完全福氏佐劑(IFA)、PBS三者按1∶3∶3的比例充分混勻制成免疫乳劑后，再取乳劑200 μl(含R97-116：50 μg)強(qiáng)化接種，對照組同樣注射等量PBS。

2.3 各組大鼠的Lennon評分 給藥前和給藥4 w后分別進(jìn)行行為學(xué)觀察，各組大鼠肌力按Lennon分級法將其分為4級：0級：沒有肯定肌無力表現(xiàn)；1級：撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且易疲勞；2級：明顯無力，休息時(shí)脊背呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動作笨拙，行走不穩(wěn)；3級：嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無嘶咬動作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。癥狀居中間者，分別評為0.5、1.5、2.5級。

2.4 EAMG大鼠造模成功的評價(jià) 造模結(jié)束后，灌胃前，經(jīng)大鼠內(nèi)眥靜脈采血以酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測AchR-Ab滴度陽性率。ELISA基本操作步驟如下：用包被緩沖液將捕獲抗體稀釋，每孔100 μl，4 ℃過夜；吸去孔內(nèi)包被液，PBST洗板，共洗5次，最后兩次用吸水紙拍干；每孔加400 μl 1%BSA，室溫封閉1 h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；棄封閉液，每孔加100 μl抗原，置濕盒中，室溫1 h；棄去孔內(nèi)溶液，同上洗滌拍干；在各反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)抗體稀釋液100 μl，置濕盒中，室溫1 h；棄去孔內(nèi)溶液，同上洗滌拍干。于各反應(yīng)孔中加入顯色液200 μl，避光顯色30 min；各反應(yīng)孔中加入終止液(1 mol H2SO4)50 μl；結(jié)果測定：酶標(biāo)儀上測讀OD490(A)值。

2.5 RT-Q-PCR檢測腎上腺細(xì)胞IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17基因表達(dá)量 灌胃4 w后，取出大鼠雙側(cè)腎上腺去掉包膜等多余組織放入EP管后，組織總RNA完整性檢測取5 μl RNA樣品+1 μl 6×DNA Loading Buffer進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。電泳結(jié)束后在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)下觀看，RNA樣品能看到非常明顯的rRNA條帶，28 SrRNA的量約為18 SrRNA的兩倍，說明RNA的完整性較好。每個(gè)樣本取1 μl RNA溶液，通過紫外分光光度計(jì)吸收測定RNA的濃度并檢測總RNA的純度，確定其高質(zhì)量(見表1)。在37 ℃、15 min、85 ℃、4 ℃條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后兩步法進(jìn)行內(nèi)參基因與目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：(1)引物序列(見表1)。(2)反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 30 s、預(yù)變性95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s共40個(gè)循環(huán)，最后為溶解曲線反應(yīng)階段，反應(yīng)結(jié)束后，采用相對定量比較CT值(△△CT)的方法得到目的基因mRNA表達(dá)的相對值。計(jì)算公式為：樣品目的基因相對表達(dá)量(F)=2-△△CT(△△CT=各樣品的△CT值-對照組平均△CT值)，△CT=樣品目的基因的CT值-樣品管家基因的CT值(以β-actin為對照)。(3)反應(yīng)完畢后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。

表1 引物序列

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 EAMG大鼠行為學(xué)表現(xiàn) EAMG大鼠造模2 w后注射部位逐漸出現(xiàn)炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為足墊紅腫，腹部及背部注射部位局部皮膚泛紅，局部鼠毛干枯、稀疏、脫落，3 w后逐漸出現(xiàn)在光滑地面上行動變慢、前肢打滑，活動減少。4 w后部分EAMG大鼠或因咀嚼無力，或因足部感染，或抬頭無力，而站立取食困難，出現(xiàn)消瘦。灌胃被持捏時(shí)背、頸部皮毛松弛，抓籠持續(xù)時(shí)間縮短，灌胃結(jié)束后出現(xiàn)呼吸困難、四肢無力，休息時(shí)脊背呈隆起姿勢，頭尾下垂，動作笨拙?？梢?只因咀嚼減少門齒過度增生。另外，我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，群居大鼠中若出現(xiàn)個(gè)別比較虛弱的個(gè)體，剩下的相對健壯的大鼠會將其咬死甚至吃掉部分尸體。故灌胃前，我們將肌無力癥狀較重的5只EAMG大鼠單獨(dú)喂飼養(yǎng)，以排除因咀嚼吞咽困難而過度虛弱，被其它大鼠咬死而造成非實(shí)驗(yàn)性死亡的可能。灌胃前強(qiáng)的松組及模型組各死亡2只，灌胃結(jié)束前模型組死亡2只，共取材30只。

3.2 EAMG大鼠血清AchR-Ab滴度檢測結(jié)果 ELISA法檢測大鼠靜脈血血清AchR-Ab滴度陽性率，其中有24只EAMG大鼠結(jié)果為陽性，其余大鼠結(jié)果均為陰性，陽性率約為66.7%，表明造模成功。

3.3 各組大鼠灌胃前后Lennon評分(見表2)。

3.4 灌胃4 w后各組大鼠血清AchR-Ab含量檢測結(jié)果(見表3)。

3.5 RT-Q-PCR檢測腎上腺細(xì)胞IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17基因表達(dá)量(見表4)。表2可見，灌胃前，EAMG大鼠肌力平均為1.38分，各組EAMG大鼠間評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；灌胃后，EAMG大鼠肌力平均為0.84分。強(qiáng)的松組與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且顯著高于模型組，說明強(qiáng)的松能夠顯著改善EAMG大鼠肌無力癥狀。表3可見，與對照組大鼠比較，強(qiáng)的松組與模型組EAMG大鼠血清AchR-Ab含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且顯著高于對照組大鼠，說明造模成功；強(qiáng)的松組與模型組比較AchR-Ab含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且低于模型組，說明強(qiáng)的松能有效降低血清AchR-Ab含量，進(jìn)而有效治療MG。表4可見，與對照組比較，模型組大鼠腎上腺中IFN-γ mRNA、TGF-β mRNA、IL-4 mRNA表達(dá)減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與對照組比較，模型組大鼠腎上腺中TNF-α mRNA、IL-17 mRNA的表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且有顯著差異；與模型組比較，強(qiáng)的松組大鼠腎上腺中IFN-γ mRNA表達(dá)減少，且有顯著差異，而強(qiáng)的松組大鼠腎上腺中TGF-β mRNA、IL-4 mRNA、TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA的表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在EAMG大鼠腎上腺中沒有IL-2 mRNA的表達(dá)。

3.6 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 除IL-2外，各組腎上腺細(xì)胞IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-4、IL-17基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳均在 Marker 100 bp～250 bp之間，約在200 bp處出現(xiàn)清晰的DNA條帶。相應(yīng)的位置出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)基本相符，故認(rèn)為其基因在各組大鼠腎上腺組織內(nèi)均有表達(dá)。

表2 各組大鼠灌胃前后Lennon評分比較

與對照組比較△P<0.01；與模型組比較*P<0.05

表3 各組大鼠AchR-Ab含量比較

與對照組比較△P<0.01；與模型組比較*P<0.05

表4 腎上腺細(xì)胞IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17基因表達(dá)量

與對照組比較△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

4 討 論

影響EAMG造模成功的因素很多，已有的研究中，EAMG模型常見選用的有Lewis大鼠、Wistar大鼠或Ig轉(zhuǎn)基因小鼠等，本實(shí)驗(yàn)選取的Lewis大鼠同Wistar大鼠相比具有HPA軸缺陷，我們前期的實(shí)驗(yàn)[1]已證明Lewis大鼠對EAMG的具有易感性。而在張芷熒[2]的研究中，EAMG模型選用的是C57BL/6小鼠，其血清IFN-α、IL-12、IL-17的含量與未造模組無明顯差異，與我們前期的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，我們推測，這可能與C57BL/6小鼠免疫補(bǔ)體活性高、細(xì)胞免疫隨增齡而降低且較易誘發(fā)免疫耐受性有關(guān)。我們認(rèn)為C57BL/6小鼠免疫特性不如Lewis大鼠更穩(wěn)定更適合EAMG的內(nèi)分泌與免疫相關(guān)性研究。而AKR小鼠及SJL小鼠未見報(bào)道用于EAMG模型研究。Lewis大鼠雖然價(jià)格較高但對于研究EAMG是大家公認(rèn)比較合適的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動物。

自身免疫性疾病MG的發(fā)病機(jī)制涉及體液免疫及細(xì)胞免疫的異常、NK/NKT細(xì)胞紊亂、樹突狀細(xì)胞異常、遺傳及內(nèi)分泌因素等多種因素。CD4+輔助細(xì)胞性T細(xì)胞(helper T Cell，Th)在MG的發(fā)病中扮演重要角色。Th首先分化為TH0細(xì)胞，而后分化為Th1細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、Th3細(xì)胞、Th17 細(xì)胞4種類型。Th1主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2;Th2主要分泌TNF-α、IL-4;Th3主要分泌TGF-β;Th17主要分泌IL-17。其中，IL-2、IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-17均能同時(shí)作用于T、B淋巴細(xì)胞，同時(shí)參與細(xì)胞免疫與體液免疫。IFN-γ可抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)且可與細(xì)胞膜上的IFN-γR結(jié)合后，通過激活Jak1和Jak2激酶使無活性的信號傳導(dǎo)于活化轉(zhuǎn)錄因子-1(signal transducer and actlvator of transcription-1,STAT-1)磷酸化為有活性的STAT-1，并使之聚合成二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，激活具有抗原提呈功能的主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ(MHC-Ⅱ)基因的轉(zhuǎn)錄及其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[3,4]，增強(qiáng)抗原提呈進(jìn)而促進(jìn)致病性AChR-Ab產(chǎn)生[5]從而導(dǎo)致MG的發(fā)生。

TNF-α可促進(jìn)胸腺細(xì)胞活化及增殖，也可通過誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞，APC活化，促進(jìn)產(chǎn)生IL-2和增強(qiáng)活化T細(xì)胞表達(dá)IL-2R而達(dá)到促進(jìn)T細(xì)胞活化及增殖作用[6]，促進(jìn)T細(xì)胞活化及增殖作用。姜廣建[7]等的研究結(jié)果顯示AchR自身抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使能分泌TNF-α的單核巨噬細(xì)胞被激活，從而產(chǎn)生大量的TNF-α，從而使MG患者血清TNF-α水平明顯高于正常。IL-4是Th2細(xì)胞分化的特征性細(xì)胞因子，能抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子來抑制細(xì)胞免疫，并可以刺激B細(xì)胞增殖、活化轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞并表達(dá)抗體來增強(qiáng)體液免疫。它是MG免疫誘導(dǎo)早期產(chǎn)生的效應(yīng)因子，參與了MG免疫啟動過程。已有的研究表明[8]，IL-4在發(fā)生危象的MG患者外周血中水平極低，血漿置換病情明顯好轉(zhuǎn)后，IL-4至少增高兩倍以上。也有研究顯示，MG患者的IL-4水平與正常人無差異，胸腺瘤的MG患者IL-4 mRNA表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量少于未切除胸腺的患者，發(fā)生危象的MG患者IL-4水平更低。因此推測IL-4可能是一種具有保護(hù)作用的因子。

TGF-β可由活化的T、B細(xì)胞及多種細(xì)胞分泌，可抑制B細(xì)胞增殖、分化及免疫效應(yīng)，抑制抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，如抑制Th1、Th2細(xì)胞的功能，減少相應(yīng)細(xì)胞因子，并能拮抗具有增強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子的功能[9]，是對EAMG具有免疫抑制作用的保護(hù)性細(xì)胞因子。MaCG[10]發(fā)現(xiàn)免疫耐受EAMG鼠淋巴器官中經(jīng)AChR刺激后活化的TGF-β mRNA表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增加，說明TGF-β在免疫耐受中起免疫抑制功能。重組的TGF-β可抑制MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞因子中AChR誘導(dǎo)的炎性因子及穿孔素的產(chǎn)生[11]。TGF-β的降低導(dǎo)致受AChR刺激過度活化T、B細(xì)胞產(chǎn)生AChR-Ab，從而導(dǎo)致EAMG的發(fā)生。IL-17是新型輔助性T細(xì)胞Th17細(xì)胞的主要細(xì)胞因子，可促進(jìn)T細(xì)胞活化，同時(shí)刺激上皮、內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞，促進(jìn)產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子[12]，從而上調(diào)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-17還可通過G蛋白Rgs13 和Rgs16調(diào)控信號的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在生發(fā)中心導(dǎo)致原始的B細(xì)胞積累[13]。

IL-17的增加可導(dǎo)致生發(fā)中心免疫應(yīng)答的增加和B細(xì)胞數(shù)量的增加。并且，體外通過IL-17刺激，可以誘導(dǎo)AChR特異性B細(xì)胞的增加。Soltys等[14]用IgG免疫吸附劑給予重癥肌無力的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者嚴(yán)重程度有所減輕，檢測治療前后的IL-17水平，發(fā)現(xiàn)治療后的IL-17減少。說明在EAMG發(fā)病過程中IL-17的增加可同時(shí)影響體液免疫和細(xì)胞免疫。IL-2是功能復(fù)雜并受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的具有促進(jìn) T、B 細(xì)胞增殖、分化和增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷毒性作用的細(xì)胞因子。一方面，IL-2在效應(yīng)性T細(xì)胞與Treg細(xì)胞起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，效應(yīng)性T細(xì)胞分泌的IL-2能夠維持并激活Foxp3+CD4+CD25+Treg，而Foxp3+CD4+CD25+Treg反過來可以抑制效應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2[15]。魏秀麗等[16]的研究表明，IL-2可誘導(dǎo)Thl細(xì)胞增殖及產(chǎn)生INF-γ、激活巨噬細(xì)胞、刺激NK細(xì)胞、促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分泌抗體，起免疫增強(qiáng)作用，IL-2在MG患者血清中呈高表達(dá),且其濃度的高低與AchR-Ab水平、肌無力嚴(yán)重程度及胸腺增生的具體情況關(guān)系密切。而另一方面，抗IL-2單克隆抗體復(fù)合物能夠增強(qiáng)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，從而抑制反應(yīng)性T細(xì)胞及B細(xì)胞對AchR-Ab的反應(yīng)，改善肌無力癥狀。

我們推測IL-2 mRNA在EAMG大鼠腎上腺中的未見表達(dá)的原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)腎上腺中IL-2R亞基組發(fā)揮免疫效用是通過與效應(yīng)細(xì)胞膜上的IL-2R結(jié)合而發(fā)揮作用，高親和力的IL-2R由3種亞基組成：IL-2Rα、IL-2Rβ和 IL-2γ[17]。其中，α亞基不參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且單獨(dú)的α亞基或β亞基對IL-2的親和力很低、γ亞基對IL-2的親和力幾乎為零。β和γ亞基結(jié)合也只能形成中等親和力的受體，但能結(jié)合大量信號分子活化多條信號通路。只有 α、β、γ 三者結(jié)合才能產(chǎn)生高親和力的 IL-2R[18]?？赡艽嬖谟贓AMG大鼠腎上腺中的IL-2R僅具備3種亞基中的一部分，因此不能產(chǎn)生高親和力的IL-2R；(2)細(xì)胞因子之間的相互作用?？赡茉贓AMG發(fā)病前期，TNF-α促進(jìn)胸腺細(xì)胞活化及增殖，也可通過誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞，APC活化，促進(jìn)產(chǎn)生IL-2，而后TGF-β的表達(dá)降低下調(diào)FOXP3的表達(dá)，從而通過阻斷多種細(xì)胞因子表達(dá)所必須的轉(zhuǎn)錄活化因子NF-κB的活化來抑制IL-2的表達(dá)；(3)血清中IL-2R的競爭性結(jié)合。sIL-2R是活化的T淋巴細(xì)胞膜上IL-2R之一，是T細(xì)胞被激活的標(biāo)志?？赡苡捎贛G患者變構(gòu)的AchR作為自身抗原刺激了機(jī)體免疫系統(tǒng),T細(xì)胞被激活后大量表達(dá)膜IL-2R,使血清sIL-2R水平升高,與膜IL-2R競爭結(jié)合免疫活性細(xì)胞周圍的IL-2能力增加，而導(dǎo)致腎上腺中IL-2活性降低；(4)其他內(nèi)分泌軸相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，MG患者比普通人更容易發(fā)生甲狀腺疾病[19～21]。且MG患者中女性發(fā)病比例高于男性，結(jié)合我們前期的研究表明，MG發(fā)病與胸腺的病理改變關(guān)系密切[22,23]，IL-2在EAMG大鼠外周血中的含量顯著升高[24]，我們推測，可能IL-2的表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中的聯(lián)系在下丘腦-垂體-性腺軸或下丘腦-垂體-甲狀腺-胸腺軸中更為顯著，其具體聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。IL-2的雙重特性使調(diào)控IL-2活性，選擇性地增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能成為研究的熱點(diǎn)。近年來，基于Treg細(xì)胞高親和力IL-2R的本構(gòu)性表達(dá)等特點(diǎn)，出現(xiàn)了多種靶向Treg細(xì)胞治療自身免疫性疾病的方法，這些治療方法在臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)動物模型中均取得了良好的效果，為IL-2治療自身免疫性疾病的新策略提供了新的靶向治療前景[25]，其在MG治療中的應(yīng)用值得期待。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腎上腺皮質(zhì)激素強(qiáng)的松能有效下調(diào)IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA、IL-17 mRNA在腎上腺的蛋白表達(dá)，同時(shí)保護(hù)腎上腺中IL-4 mRNA，TGF-β mRNA的蛋白表達(dá)，這可能是其治療MG的作用機(jī)制之一。腎上腺是EAMG的發(fā)病過程中的環(huán)節(jié)之一，我們進(jìn)而推測MG不僅僅是自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制亦涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)的多個(gè)層次和環(huán)節(jié)，針對EAMG內(nèi)分泌系統(tǒng)的治療值得期待。