云南普洱江城縣草地貪夜蛾幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及鑒定

張凌英，蘇造堂，徐天梅，張志紅，鄭亞強(qiáng)，桂富榮，2**，陳 斌*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201；2. 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院, 昆明 650201)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)又名秋粘蟲，隸屬于鱗翅目Lepiodoptera夜蛾科Noctuidae。它是一種源于美洲大陸的毀滅性農(nóng)業(yè)害蟲，具有飛行能力強(qiáng)、增殖數(shù)量大、寄主種類多、種群優(yōu)勢(shì)明顯、突發(fā)危害嚴(yán)重等特點(diǎn)(Todd and Poole，1980)。該蟲于2019年1月首次遷入我國云南省普洱市江城縣(楊學(xué)禮等，2019)，之后迅速向我國其他省區(qū)蔓延，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響玉米生產(chǎn)的重要害蟲(齊國君等，2019)。張麗紅(2019)研究發(fā)現(xiàn)該蟲對(duì)很多農(nóng)藥如有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類具有抗藥性，防治困難。

昆蟲腸道存在著種類多、數(shù)量大的微生物類群，這些微生物與昆蟲行為有著密切聯(lián)系，比如在躲避天敵(張振宇，2017)、增強(qiáng)抗藥性(Chengetal., 2017)及適應(yīng)生態(tài)位變化(Chengetal., 2019)等過程中具有重要作用。為了適應(yīng)不同環(huán)境條件，這些微生物也隨之發(fā)生進(jìn)化，然而腸道微生物的多樣性與昆蟲的種類、地域、食物及外界環(huán)境等有關(guān)(Corbyharrisetal., 2007; Zhangetal., 2018)，導(dǎo)致同種昆蟲會(huì)因其食物、地理環(huán)境或者生長發(fā)育的差異而表現(xiàn)出種類和數(shù)量不同的微生物，也表現(xiàn)出不同種昆蟲在取食相同食物、經(jīng)歷相同的環(huán)境變化及同一地區(qū)其腸道中微生物的種類和數(shù)量也不同(Chenetal., 2018)。昆蟲體內(nèi)大部分細(xì)菌屬于變形菌門，但是多數(shù)研究表明，厚壁菌門同樣是鱗翅目昆蟲腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群(陳勃生等，2017)。國外，美國和巴西已對(duì)草地貪夜蛾腸道微生物開展了研究(Acevedoetal.，2017；Almeidaetal.，2017)，而國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究采集江城縣寶藏鎮(zhèn)水城村勐野壩地區(qū)玉米田中的草地貪夜蛾為樣本，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法以及16S rRNA測(cè)序?qū)Σ莸刎澮苟甑哪c道優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了初步分離鑒定，以期為后續(xù)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

蟲源：采集于江城縣寶藏鎮(zhèn)水城村勐野壩玉米田，海拔790 m，E101.63°，N22.68°。

LB培養(yǎng)基：10 g氯化鈉，5 g酵母浸粉，10 g胰蛋白胨，15～20 g瓊脂，pH7.0，dd H2O：1 L，121℃高壓(101 kPa)蒸汽滅菌20 min(黃秀梨和辛明秀，2008)。

NA培養(yǎng)基：5 g氯化鈉，5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，15～25 g瓊脂，pH7.4～7.6，dd H2O：1 L，121℃高壓(101 kPa)蒸汽滅菌20 min(黃秀梨和辛明秀，2008)。

試驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰，SW-CJ-1FD)、高壓蒸汽滅菌鍋(申安，LDZM-40KCS-Ⅱ)、恒溫培養(yǎng)箱(恒立，RG-300)、離心機(jī)(恒諾，2～16R)、PCR儀(美國伯樂，T100)、電泳儀(美國伯樂，1645050 )、顯微鏡(德國萊卡，ICC50W)。

1.2 研究方法

1.2.1草地貪夜蛾中腸腸道原液的制備

取5頭健康的草地貪夜蛾5齡幼蟲，饑餓1 d，用無菌水清洗幼蟲體表的污染物，再用75%消毒酒精對(duì)幼蟲體表消毒4 min，最后放入無菌水中清洗表面的酒精。在放有滅菌的磷酸緩沖液的滅菌培養(yǎng)皿中，用鑷子從蟲體尾部取出腸道，用鑷子小心去除前腸和后腸以及部分馬氏管，將處理好的中腸放入1.5 mL無菌離心管中并用尖鑷子搗碎，加入少量滅菌的磷酸緩沖液使搗碎的腸道成勻漿狀，最后繼續(xù)加入磷酸緩沖液定容至1 mL，以此作為腸道原液備用(鄭亞強(qiáng)等，2017)。

1.2.2腸道原液中細(xì)菌的分離及純化

將準(zhǔn)備好的腸道原液取0.1 mL于含有0.9 mL磷酸緩沖液離心管配制成10-1，按照此方法依次類推分別稀釋到10-3～10-8稀釋濃度梯度。用移液槍分別從6個(gè)濃度梯度中從低到高取0.1 mL均勻涂布于兩種固體培養(yǎng)基，重復(fù)3次。把涂布好的固體培養(yǎng)基放置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，24 h后挑選出菌落數(shù)在30～300的平板，統(tǒng)計(jì)各平板上菌落顏色、形態(tài)和大小各異細(xì)菌菌落的數(shù)量，并用接種環(huán)挑取不相同的單菌落多次平板劃線，直到獲得純菌株。將純化好的菌株分別編號(hào)，并且對(duì)每個(gè)編號(hào)下的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，通過萊卡顯微鏡(100×物鏡)觀察。

1.2.3細(xì)菌菌株分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究采用凍溶法提取細(xì)菌DNA，具體操作如下：分別從已經(jīng)純化好的LB或者NA平板中挑取單菌落于1.5 mL無菌離心管中，然后加入0.5 mL無菌蒸餾水渦旋振蕩混勻。然后將混勻后的菌懸液于裝有液氮的冰盒中冷凍10 min，緊接著將離心管固定在泡沫漂盤上沸水浴5 min，最后 12 000 r/min高速離心2 min(馮廣達(dá)等，2013)，以上清液作為PCR模板。

1.2.4采用細(xì)菌通用引物27F和1492R(鄭亞強(qiáng)等，2017)，擴(kuò)增體系與條件如下：

反應(yīng)條件: 94℃熱變性5 min；94℃變性1 min；53℃退火1 min；72℃延伸2 min；32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將達(dá)標(biāo)PCR產(chǎn)物送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 PCR 反應(yīng)體系

1.3 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算每種菌菌株的相對(duì)豐度，計(jì)算公式為：相對(duì)豐度(%)=某種菌菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100。

利用Contigexpress軟件對(duì)雙向測(cè)序原始序列進(jìn)行拼接和校對(duì)，并切除首尾亂序形成一條較為完整的序列，提交至NCBI(GenBank)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，查找并下載與各菌株具有最高相似度的同源序列。將下載的序列通過MEGA 7.0軟件，采用通用的鄰位相連法(Neighbour-Joining)、Kimura雙參數(shù)矯正模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自導(dǎo)復(fù)制評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育樹的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征

從稀釋涂布培養(yǎng)的LB和NA培養(yǎng)基上得到菌落形態(tài)各異的18個(gè)細(xì)菌菌株。其中共有12種典型的顏色、形狀、大小各不相同的細(xì)菌菌落，其菌落的形態(tài)為圓形和不規(guī)則形，且圓形較多；顏色有白色、乳白色、黃色、淡黃色、紅色(表2)。通過革蘭氏染色后，11株顯示為陽性，7株顯示為陰性。100×物鏡下觀察到其細(xì)胞形態(tài)10株為球形，4株為桿狀，3株為短桿狀，1株為棒狀。

2.2 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rRNA序列分析結(jié)果

將草地貪夜蛾腸道中分離得到的18株可培養(yǎng)細(xì)菌通過16S rRNA序列分析法進(jìn)行鑒定，將校對(duì)好的測(cè)序結(jié)果與NCBI中模式菌株序列進(jìn)行相似性對(duì)比。結(jié)果如表3所示，它們分別屬于2門2綱4目 6科8屬：與腸球菌屬Enterococcus相似性在99%以上的有8株、與芽孢桿菌屬Bacillus相似性在99%以上的有1株、與巨球菌屬M(fèi)acrococcus相似性在99%以上的有1株、與葡萄球菌屬Staphylococcus相似性在99%以上的有1株、與普羅威登斯菌屬Providencia相似性在99%以上的有1株、與克雷伯氏菌屬Klebsiella相似性在99%以上的有2株、與沙雷氏菌屬Serratia相似性在99%以上的有2株、與不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter相似性在99%以上的有1株。

表2 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細(xì)菌的菌落形態(tài)及培養(yǎng)性狀

續(xù)表2 Continued table 2

菌株編號(hào)Strain No.革蘭氏染色Grams dyeing菌體形狀Strain morphology培養(yǎng)特征Culture characterNR03+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則透明,乳白,凸起,濕潤,較小。Round,Regular and transparent edges,Creamy White,Bulge,Moist,Smaller.105341+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105142+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.104122+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,淡黃色,扁平,半透明,濕潤,較小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105321+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,黃色,扁平,半透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.104242+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,黃色,扁平,半透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.103311+桿狀Rod-shaped圓形,邊緣放射狀透明,淡黃色,扁平,不透明,半濕潤。Round,Ra-dially transparent margin,Yellowish,Flat,Opaque,Semi humid.10351+球形Spherical圓形,邊緣規(guī)則,黃色,凸起,不透明,濕潤。Round,Regular edge,Yellow,Bulge,Opaque,Moist.NR05+球形Spherical不規(guī)則,邊緣細(xì)小瓣?duì)?黃色,中央微凸有褶皺,不透明,濕潤。Irregu-lar,Edge small petal,Yellow,Center slightly convex with fold,Opaque,Moist.NR01-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規(guī)則,黃色到淡黃,凸起,不透明,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Yellow to yellowish,Bulge,Opaque,Moist,Glossy.10412-短桿狀Short rod圓形,邊緣規(guī)則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.NR04-短桿狀Short rod圓形,邊緣規(guī)則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.104111-短桿狀Short rod圓形,邊緣規(guī)則,白色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.10461-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規(guī)則,深紅,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Crimson,High bulge,Moist,Glossy.NR02-桿狀Rod-shaped圓形,邊緣規(guī)則,初期深紅后期四周褪色,高凸,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,Early crimson and late four week fading,High bulge,Moist,Glossy.NR06-棒狀Stick-shaped圓形,邊緣規(guī)則,白色,凸起,濕潤,有光澤。Round,Regular edge,White,Bulge,Moist,Glossy.

注：其中編號(hào)為10351-105341為LB培養(yǎng)基分離得到的菌株，編號(hào)為NR01-NR06為NA培養(yǎng)基分離得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

表3 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細(xì)菌的16S rRNA序列比對(duì)分析結(jié)果

注：其中編號(hào)為10351-105341為LB培養(yǎng)基分離得到的菌株，編號(hào)為NR01-NR06為NA培養(yǎng)基分離得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

2.4 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細(xì)菌鑒定結(jié)果

綜合各菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形態(tài)和染色反應(yīng)等各項(xiàng)指標(biāo)，共鑒定出細(xì)菌2門2綱4目6科8屬。其中從LB培養(yǎng)基中分離到2門2綱3目 4科 5屬，分別為腸球菌屬、芽孢桿菌屬、巨球菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬，其中腸球菌屬所占比例最高為65.06%。從NA培養(yǎng)基中分離到2門2綱4目6科6屬，分別為腸球菌屬、葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、普羅威登斯菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬，其中腸球菌屬所占比例同樣最高為44.20%(圖1)。可以確定腸球菌屬是草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中的優(yōu)勢(shì)屬，且種水平多樣性最高。通過LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基獲得隸屬于該屬的菌株有3種，分別為蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii、鉛黃腸球菌Enterococcuscasseliflavus和鶉雞腸球菌Enterococcusgallinarum(表4)。

表4 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果及存在數(shù)量

圖1 LB(A)和NA(B)培養(yǎng)基上分離細(xì)菌在屬分類水平的群落組成Fig.1 The composition of bacteria community isolated from LB(A)and NA(B)media at genus level

3 結(jié)論與討論

本研究通過細(xì)菌通用培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基從草地貪夜蛾中腸中總共分離到18株細(xì)菌，隸屬于2門2綱4目6科8屬。在門水平上本研究分離得到的兩個(gè)門分別是變形菌門和厚壁菌門，這與Snyman等(2016)報(bào)道的在鱗翅目昆蟲腸道中微生物的優(yōu)勢(shì)門具有一致性。在屬水平上，所分離到的菌株分別為腸球菌屬、芽孢桿菌屬、巨球菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、萄球菌屬、普羅威登斯菌屬、不動(dòng)桿菌屬，其中腸球菌屬的豐度最高，分別占LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基所有分離菌株的65.06%和44.20%，可以確定該屬是云南江城地區(qū)草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中的優(yōu)勢(shì)屬。據(jù)報(bào)道，腸球菌屬有很多種類能夠產(chǎn)生乙酸鹽，進(jìn)一步調(diào)節(jié)昆蟲腸道內(nèi)的pH值，起到保護(hù)昆蟲免被毒素毒害的功能(張玨鋒等，2013)；克雷伯氏菌屬的一些菌株可降解部分有機(jī)磷殺蟲劑如：毒死蜱、敵百蟲；同時(shí)也能降解少部分菊酯類殺蟲劑如：溴氰菊酯。不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的一些菌株可降解溴氰菊酯(南春燕，2013)。然而，草地貪夜蛾腸道中分離到的這些細(xì)菌是否具有降解農(nóng)藥的作用，值得進(jìn)一步深入探究。

國外，巴西學(xué)者從大豆飼養(yǎng)的草地貪夜蛾 5齡幼蟲腸道中分離到8個(gè)屬的細(xì)菌(Almeidaetal.，2017)，分別為腸球菌屬Enterococcus、節(jié)細(xì)菌屬Arthrobacter、勒克氏菌屬Leclercia、細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium、代爾夫特菌屬Delftia、假單胞菌屬Pseudomonal和葡萄球菌屬Staphylococcus。美國從玉米葉飼養(yǎng)第14代的草地貪夜蛾3齡幼蟲腸道中分離到5個(gè)屬的細(xì)菌，分別為腸桿菌屬Ebterbacter、拉恩氏菌屬Rahnella、克雷伯氏菌屬Klebsiella、拉烏爾菌屬Raoutella、和泛菌屬Pantoea(Acevedoetal.，2017)。我國唐運(yùn)林等(2019)對(duì)采自重慶玉米地的草地貪夜蛾幼蟲腸道中發(fā)現(xiàn)8個(gè)屬的細(xì)菌，分別為克雷伯氏菌屬Klebsiella、假單胞菌屬Pseudomonas、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、氣單胞菌屬Aeromonas、腸桿菌屬Enterobacter、金黃桿菌屬Chryseobacterium、短波單胞菌屬Brevundimonas以及腸球菌屬Enterococcus。與巴西、美國、及重慶3個(gè)地方的研究相比，云南江城地區(qū)與以上地區(qū)的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌存在一定的重合性，這可能是由于同一物種腸道微環(huán)境具有一定保守性導(dǎo)致的。同時(shí)也存在明顯差異性，芽孢桿菌屬Bacillus、沙雷氏菌屬Serratia、巨球菌屬M(fèi)acrococcus、普羅威登斯菌屬Providencia等4個(gè)屬在云南省江城縣玉米田草地貪夜蛾腸道中分離獲得，而在文獻(xiàn)報(bào)道的其他地區(qū)未分離到，究其原因可能與地理位置、宿主植物、飼養(yǎng)代數(shù)以及齡期等差異有關(guān)，然而具體原因?qū)⑹沁M(jìn)一步研究的重要內(nèi)容。此外，昆蟲腸道細(xì)菌是影響昆蟲生長發(fā)育、抗藥性和遷飛等習(xí)性的重要因素(張振宇等，2017)，然而草地貪夜蛾腸道中這些細(xì)菌是否也會(huì)影響草地貪夜蛾的抗性和生長發(fā)育等，還有待進(jìn)一步研究。