成蟲飼料中糖與奶粉不同配比對(duì)家蠅繁殖力及卵黃蛋白發(fā)生的影響

劉鍵柏，趙 甜，趙培雅，毛宇翔，顏志波，王方海，李廣宏

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

家蠅MuscadomesticaL.具有生活周期短，繁殖力強(qiáng)，食物來源豐富和耐高密度養(yǎng)殖等特點(diǎn)(王芳等，2013)。其幼蟲(俗稱蠅蛆)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量豐富、氨基酸構(gòu)成合理，還富含人體及其它動(dòng)物所需的不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外家蠅體內(nèi)還含有甲殼素、抗菌肽、凝集素等生物活性物質(zhì)(李穎和王紅育，2009)，是國(guó)際上重視和開發(fā)利用較早的資源昆蟲。我國(guó)在20世紀(jì)80年代初開始研究家蠅的人工飼養(yǎng)與開發(fā)利用，經(jīng)多年研究，已在人工養(yǎng)殖技術(shù)和應(yīng)用開發(fā)上取得了良好進(jìn)展。但是，在家蠅的大規(guī)模飼養(yǎng)中仍存在許多問題，其中成蠅的高效養(yǎng)殖到目前為止也未得到很好解決，以致在生產(chǎn)中，成蟲產(chǎn)卵效率仍較低，養(yǎng)殖成本偏高，這在一定程度上制約了家蠅的規(guī)?；a(chǎn)，也阻礙了蠅蛆在飼料行業(yè)的推廣應(yīng)用。

與自然種群相比，人工飼養(yǎng)的家蠅產(chǎn)卵力較低，因而,如何提高種蠅的繁殖力就成為了家蠅規(guī)模化生產(chǎn)中的關(guān)鍵問題之一(孫剛等，2002)。前人已研究了環(huán)境條件(姜曉舜等1993；陳文龍等，1996；紀(jì)偉華等，2000；向玉勇和張敏智，2011)、地理種群(陳曉敏等，2009)、成蟲營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充料(黃懷昭等，1982；賽書元等，1991；姜曉舜等，1993；陳文龍等，1996)和種群密度(陳文龍等，1996；紀(jì)偉華等，2001；孫剛等，2002)等對(duì)成蠅產(chǎn)卵的影響。其中在家蠅成蟲飼料方面，多數(shù)研究認(rèn)為以奶粉加糖作為種蠅飼料產(chǎn)卵力最高，但兩者的適宜比例是多少，有關(guān)此目前尚無報(bào)道。鑒于此，本文研究了成蟲飼料中糖與奶粉不同配比對(duì)家蠅繁殖力及卵黃蛋白合成的影響，旨在為家蠅成蟲的高效養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1供試蟲源

家蠅由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要原料與試劑

某品牌全脂奶粉(市售，蛋白質(zhì)20%、脂肪24%和乳糖47%)，白砂糖(市售)，麥麩購(gòu)自南方面粉廠。辣根過氧化物HRP、透析袋、牛血清蛋白(BSA)、羊抗兔酶標(biāo)二抗、96孔平板(Thermo Scientific)、Protein G Sepharose等購(gòu)自廣州浩瑪生物科技有限公司。NaHCO3、Na2CO3、Na2HPO4·12 H2O、NaCL、硫酸銨、NaBH4、NaIO4、HAc均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1家蠅成蟲飼料配制

將定量奶粉與白砂糖混合均勻，粉碎，裝于塑料袋中，于4℃冰箱保存。7組飼料如下：A1組：100%奶粉+0%糖；A2組：80%奶粉+20%糖；A3組：60%奶粉+40%糖；A4組：50%奶粉+50%糖；A5組：40%奶粉+60%糖；A6組：20%奶粉+80%糖；A7組：0%奶粉+100%糖；

1.2.2成蟲飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅繁殖力的影響

選同一天羽化的健康雌、雄成蠅42對(duì)，放入直徑7 cm、高10 cm玻璃瓶中，每瓶1對(duì)，并將42對(duì)成蟲分為7組，分別飼喂7種不同飼料，重復(fù)6次。每日加入定量飼料，更換吸有水的海綿，同時(shí)加入含水量為65%～70%的新鮮麥麩，供成蟲產(chǎn)卵，記錄和測(cè)定成蟲每日的產(chǎn)卵量、卵孵化率及成蟲死亡等情況，統(tǒng)計(jì)家蠅成蟲單雌產(chǎn)卵量、卵孵化率、雌雄成蟲壽命、產(chǎn)卵前期和產(chǎn)卵期，直到實(shí)驗(yàn)家蠅成蟲死亡。實(shí)驗(yàn)條件：溫度26℃±1℃；RH 65%±10%；光照L ∶D=12 h ∶12 h。

1.2.3成蟲飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅卵黃蛋白合成的影響

1.2.3.1 家蠅卵黃蛋白分離提取

收集家蠅產(chǎn)下的新鮮卵粒，經(jīng)蒸餾水清洗后用濾紙吸干多余水分，在0.4 mol/L NaCl (0.1% PMSF, 0.02% EDTA)溶液中勻漿(每克卵加10 mL溶液)，1 000 r/min離心30 min，取上清液迅速按1 ∶10的比例加入預(yù)冷的雙蒸餾水，4℃過夜，使卵黃蛋白沉淀，5 000 r/min離心20 min，取沉淀物再溶于0.4 mol/L NaCl溶液中，經(jīng)低速離心后取上清液，再按上述比例加入預(yù)冷的雙蒸水，使卵黃蛋白再次沉淀。依上述方法重復(fù)2～3次，即可得到較純的卵黃蛋白。

1.2.3.2 家蠅卵黃蛋白抗體制備與純化

將純化的卵黃蛋白送廣州浩瑪生物科技有限公司免疫家兔制備抗血清，并經(jīng)ProteinG瓊脂糖凝膠層析純化抗體。

1.2.3.3 家蠅卵黃蛋白酶標(biāo)抗體制備

取5 mg辣根過氧化物酶(HRP)溶于0.5 mL雙蒸水中，加入新配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混勻，置4℃冰箱靜置30 min；取出后加入0.06 mol/L乙二醇水溶液0.5 mL，室溫放置30 min；加入含5 mg純化抗體的水溶液1 mL，混勻，并裝入透析袋，用0.05 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6 h(或過夜)，使之結(jié)合；加入5 mg/L NaBH4溶液0.2 mL，混勻，置4℃冰箱靜置2 h；在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃冰箱靜置30 min，離心，去上清，沉淀以少許0.02 mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析除鹽過夜；次日取出離心，除去不溶物，即得酶-抗體(HRP-IgG)結(jié)合物，以0.02 mol/L pH7.4 PBS液加至5 mL；效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量?jī)?yōu)質(zhì)甘油，分裝小瓶，低溫保存。

1.2.3.4 間接酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測(cè)定

用包被緩沖液將抗原稀釋至適合的濃度，每孔中加入100 μL，置于37℃下溫育2 h； 倒去孔板中液體，每孔加入100 μL洗滌緩沖液，靜止3 min后倒掉，甩干板孔內(nèi)液體，如此洗板3次。然后每孔加入100 μL的封閉緩沖液，置于37℃下溫育1 h，同上洗板3次；再在每孔中加入制備好的100 μL抗家蠅卵黃蛋白酶標(biāo)抗體，置于37℃下溫育1 h，洗板3次；每孔加入TMB底物顯色液100 μL，于37℃暗處放置10 min后加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，5 min內(nèi)用Model 680酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定96孔酶標(biāo)板每孔的吸光度。

1.2.3.5 樣品制備

分別從7種不同飼料飼養(yǎng)的家蠅成蟲中，自雌蠅羽化后第一天開始起，連續(xù)15 d每天每組取3頭雌蠅，冷凍麻醉后用蒸餾水清洗，然后用干凈濾紙將蟲體表面的水吸干，置于小型研磨器中加入1mL預(yù)冷滅菌的昆蟲生理鹽水(0.75% NaCl, 0.1% PMSF, 亮抑蛋白酶肽Leupeptin 5 μg/mL, 抑蛋白酶肽Aprotinin 1 μg/mL, 0.02% EDTA)進(jìn)行研磨勻漿，然后吸入Eppendorf管中，5 000 r/min離心20 min，取其上清液體于Eppendorf管中，置于-20℃冰箱備用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，結(jié)果采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way-ANOVA)，Duncan’s多重比較法分析試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 成蟲飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅繁殖力的影響

用不同配比的糖和奶粉飼養(yǎng)家蠅成蟲，其平均單雌產(chǎn)卵量存在差異，其中以A3產(chǎn)卵最高，為1 935.83粒/雌，而全部用糖飼養(yǎng)的成蟲(A7)產(chǎn)卵量最低，平均每雌僅產(chǎn)328.17粒。經(jīng)方差分析，A3與其余各組差異顯著，A2和A4間無差異，但與其余各組均存在顯著差異，而A1、A5、A6和A7均差異顯著。說明不用奶粉僅用糖飼養(yǎng)家蠅成蟲，單雌產(chǎn)卵量明顯低于其它各組，但使用蛋白含量過高的飼料飼養(yǎng)，產(chǎn)卵量也會(huì)下降。當(dāng)成蠅餌料中糖的添加比例在20%～60%時(shí)，各組雌蟲壽命差異不顯著，但顯著長(zhǎng)于用純奶粉(A1)或糖含量超過80%的處理組，純奶粉組雌蟲壽命又顯著長(zhǎng)于糖含量超過80%組，其中又以全部用糖飼養(yǎng)的雌蟲壽命最短，顯著短于其它各組。雄蟲隨著餌料中糖比例的增加，壽命延長(zhǎng)，當(dāng)糖含量低于50%時(shí)，雄蟲壽命顯著短于糖含量高于50%的處理組。產(chǎn)卵前期各組差異不顯著，產(chǎn)卵期以糖含量40%～60%時(shí)最長(zhǎng)，餌料中糖的比例超出此范圍，產(chǎn)卵期顯著縮短。卵孵化率隨餌料中糖比例的增加而下降，當(dāng)糖的添加比例超過60%以后，卵孵化率顯著降低，其中以全部使用糖的孵化率最低(表1)。經(jīng)分析比較，初步確定用60%奶粉+40%糖作為家蠅成蟲營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充料飼養(yǎng)效果最佳。

表1 飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅成蟲壽命及繁殖力的影響

注:表中數(shù)據(jù)為6次重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)在P<0.05水平上差異顯著。Notes: Data in table are mean±SD of six replicates. The different small letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 by Duncan’s multiple range test.

2.2 成蟲飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅卵黃發(fā)生的影響

雌蠅取食含糖量不同的奶粉，其逐日合成的卵黃蛋白及羽化后15 d合成的總卵黃蛋白數(shù)量不同(表2)?？偟膩碚f，雌蠅取食含糖量越高的飼料，其每日合成的卵黃蛋白及羽化后15 d合成的總卵黃蛋白也越少，尤其是當(dāng)雌蠅羽化后完全攝取糖而不補(bǔ)充蛋白，其羽化后每日合成的卵黃蛋白均維持在一個(gè)比較低的水平，但如果蛋白質(zhì)補(bǔ)充過多，當(dāng)奶粉在飼料中的比例達(dá)到并超過60%后，雌蠅每日合成的卵黃蛋白及羽化后15 d合成的總卵黃蛋白基本不隨餌料中蛋白質(zhì)的增加而增加。經(jīng)方差分析，A1、A2和A3組15 d總卵黃蛋的合成量顯著高于A4、A5、A6和A7，但它們3組間差異不顯著；A4和A5組15 d總卵黃蛋的合成量又顯著高于A6和A7，它們之間差異不顯著；A6與A7差異顯著。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用60%奶粉+40%糖作為家蠅成蟲營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充飼料，其15 d總卵黃蛋白合成量不僅能保持相對(duì)高的水平，而且也較為經(jīng)濟(jì)。由此從生理的角度進(jìn)一步證明了用60%奶粉+40%糖飼養(yǎng)雌蠅，其不僅能保持雌蠅良好的繁殖力，同時(shí)飼養(yǎng)成本也較低。

表2 飼料中糖和奶粉不同配比對(duì)家蠅卵黃發(fā)生的影響(μg/雌)

續(xù)表2 Continued table 2

日齡(d)AgeA1A2A3A4A5A6A78148.18151.75154.09149.55149.35142.9214.269157.38149.04146.75147.35140.86138.518.1810166.65164.24157.18138.79149.61145.6913.3711171.95157.25140.11141.37141.59140.6611.7912138.78147.95151.86151.29139.39146.723.8413154.81142.42156.17150.16144.99149.862.3614151.83166.66166.76135.70131.66138.790.5815151.55164.64167.32150.19138.61134.690.0215日總卵黃蛋白Total content of vitellin for 15 days1 811.66±6.69 a1 818.77±34.48 a1 806.80±11.01 a1 706.41±20.35 b1 675.08±53.66 b1 607.50±42.01 c132.07±37.19 d

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)在P<0.05水平上差異顯著。Notes: Data in table are mean±SD of three replicates. The different small letters in the same row indicate significant difference atP<0.05 by Duncan’s multiple range test.

3 結(jié)論與討論

成蟲期營(yíng)養(yǎng)在昆蟲生殖行為中具有重要的作用(Boggs，1986)，而家蠅成蟲飼料的蛋白含量高低直接影響家蠅成蟲的繁殖力。賽書元等(1991)研究發(fā)現(xiàn)飼以奶粉為主的餌料，雌蠅產(chǎn)卵量大，而飼以動(dòng)物糞便和動(dòng)物內(nèi)臟，產(chǎn)卵量極小，單飼白糖的成蠅不產(chǎn)卵。陳文龍等(1996)分別用奶粉+蔗糖+水(3種成分用小培養(yǎng)皿分開放置)；奶粉+蔗糖水漬液(分置)；雞糞水漬液；雞糞水潰液+蔗糖(分置)；鴿糞水漬液和鴿糞水漬液+蔗糖(分置)6種飼料飼養(yǎng)家蠅成蟲，證明用含有奶粉的飼料飼養(yǎng)，成蠅產(chǎn)卵量明顯地高于動(dòng)物糞便或其他試驗(yàn)基質(zhì)。黃懷昭等(1982)研究表明用含奶粉的餌料飼養(yǎng)家蠅，產(chǎn)卵量遠(yuǎn)高于用豬、雞糞作餌料的家蠅成蟲。本研究也發(fā)現(xiàn)，在家蠅成蟲飼料中添加奶粉可提高雌蠅的產(chǎn)卵量。該研究結(jié)果與賽書元等(1991)、陳文龍等(1996)及黃懷昭等(1982)的基本一致。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中奶粉添加比例過高或完全使用奶粉，成蠅產(chǎn)卵量反而下降，這與棉鈴蟲Helithisarmigera(吳坤君等，1993)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(李廣宏，1998)成蟲對(duì)蛋白的需求一致。王爭(zhēng)艷等(2010)研究發(fā)現(xiàn)家蠅完全取食紅糖可正常產(chǎn)卵，因此認(rèn)為蛋白質(zhì)不是刺激雌家蠅產(chǎn)卵的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，本研究支持了這一觀點(diǎn)，但與賽書元等(1991)單飼白糖成蠅不產(chǎn)卵的結(jié)果不同，具體原因尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)成蠅餌料中白糖的添加比例為20%～60%時(shí)，雌蟲壽命和產(chǎn)卵期均差異不顯著，但用純奶粉或飼料中糖含量超過80%時(shí)，雌蟲壽命和產(chǎn)卵期顯著縮短；雄蟲壽命則隨著餌料中白糖比例的增加而延長(zhǎng)；同時(shí)還證明雌蠅產(chǎn)卵前期不受奶粉與白糖配比變化的影響。這與蔗糖可顯著提高龜紋瓢蟲Propyleajaponica雌蟲的體重，在一定程度縮短產(chǎn)卵前期，同時(shí)還能顯著提高成蟲的產(chǎn)卵量的結(jié)果不同(張麗莉等，2007)，也與家蠅取食蛋白質(zhì)能提前雌蠅的產(chǎn)卵期不同(王爭(zhēng)艷等，2010)，推測(cè)與昆蟲種類及提供的蛋白質(zhì)種類不同有關(guān)。

在卵孵化率方面，家蠅卵孵化率隨餌料中糖比例的增加而下降，尤其當(dāng)糖的添加比例超過60%以后，孵化率下降尤為顯著。說明家蠅成蟲飼料中蛋白質(zhì)的缺乏，不僅影響成蟲的產(chǎn)卵數(shù)量，而且也影響卵孵化率。推測(cè)可能是由于雌蠅取食含糖量過高的飼料后，導(dǎo)致部分卵發(fā)育不完全，使之難以正常孵化。

營(yíng)養(yǎng)因子是影響昆蟲卵黃發(fā)生的重要因子，它一方面提供其生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面取食活動(dòng)和食物的刺激是激活內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個(gè)信號(hào)(龔和和翟啟慧，1979)。對(duì)家蠅營(yíng)養(yǎng)研究的結(jié)果顯示，營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)卵黃蛋白合成有較大影響，取食蔗糖或缺蛋白質(zhì)的飼料不能使其卵巢正常發(fā)育，卵子無法形成，而取食蛋白質(zhì)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育(Sakauri, 1977; Aguietal., 1985； Adams and Grest, 1991, 1992 a, 1992)。本研究證明雌蠅取食含糖量越高的飼料，其每日合成的卵黃蛋白及羽化后15 d合成的總卵黃蛋白也越少，尤其是當(dāng)雌蠅羽化后完全攝取糖而不補(bǔ)充蛋白，其每日合成的卵黃蛋白均維持在一個(gè)比較低的水平，但如果蛋白質(zhì)補(bǔ)充過多(如奶粉在飼料中的比例超過60%)，雌蠅每日合成的卵黃蛋白及羽化后15日合成的總卵黃蛋白基本不隨餌料中蛋白質(zhì)的增加而增加，該結(jié)果與熱孜萬等(1997)的一致。

綜上可知，成蠅補(bǔ)充充足的蛋白質(zhì)及適量糖，可以有效提高家蠅生殖力，但蛋白補(bǔ)充過多或過少則會(huì)降低成蠅繁殖力。經(jīng)比較，作者認(rèn)為以60%奶粉+40%白糖飼養(yǎng)家蠅成蟲，其繁殖力最高，成本也較合理。