氧化鋯基微量元素共摻雜羥基磷灰石增韌涂層研究

代釗, 王銘, 王雙, 李靜, 陳翔, 汪大林, 祝迎春

氧化鋯基微量元素共摻雜羥基磷灰石增韌涂層研究

代釗1, 王銘2, 王雙1, 李靜1, 陳翔1, 汪大林1, 祝迎春2

(1. 上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院, 上海 200433; 2. 中國(guó)科學(xué)院 上海硅酸鹽研究所, 中國(guó)科學(xué)院特種無(wú)機(jī)涂層重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200050)

氧化鋯陶瓷具有良好的力學(xué)性能和生物相容性, 是一種應(yīng)用前景廣闊的硬組織植入體材料。為促進(jìn)植入體與骨組織形成穩(wěn)定的骨結(jié)合, 本研究利用等離子噴涂制備了氧化鋯增韌的鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(ZrO2-DHA)涂層, 對(duì)涂層物相、形貌以及力學(xué)性能和體外生物學(xué)性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 鍶、硅、氟的共摻雜通過(guò)成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高了羥基磷灰石涂層對(duì)成骨細(xì)胞的黏附和分化等生物學(xué)性能; 不同復(fù)合組分的ZrO2-DHA涂層均不同程度地促進(jìn)了小鼠成骨前體細(xì)胞的細(xì)胞活力和成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第7 d, DHA含量為70%的ZrO2-DHA涂層(7DHA)和的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的約2.8倍和2.3倍; ZrO2-DHA涂層的力學(xué)性能隨氧化鋯組分的增加而增強(qiáng), DHA涂層和7DHA涂層的硬度和結(jié)合強(qiáng)度分別為250.8、313 HV和25.1、31.8 MPa; 7DHA涂層中的交織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu), 對(duì)殘余熱應(yīng)力、壓應(yīng)力和拉伸力的承受能力較DHA涂層明顯提升, 滿足植入體應(yīng)用需求。

鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石; 等離子噴涂; 氧化鋯增韌; 力學(xué)性能; 成骨

近年來(lái), 氧化鋯(Zirconia, ZrO2)陶瓷作為硬組織植入物受到了持續(xù)關(guān)注, 在口腔植入體方面的應(yīng)用逐漸增加。氧化鋯陶瓷具有優(yōu)異的斷裂韌性、彈性模量[1-3], 能夠耐受長(zhǎng)期負(fù)荷, 其生物相容性也早已得到證實(shí)[4-5]。此外, 氧化鋯還能夠滿足患者日益提高的美學(xué)要求, 避免鈦金屬引起的潛在健康危害, 如植入體周圍炎癥、過(guò)敏反應(yīng)等[6-8]。然而氧化鋯屬于生物惰性陶瓷, 在其表面制備生物活性涂層是促進(jìn)植入體早期骨整合的有效方法。

羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)作為植入體涂層材料已有多年臨床應(yīng)用, 是一種與人體骨磷灰石結(jié)構(gòu)類似的人工合成鈣磷陶瓷材料。而天然羥基磷灰石含有除鈣磷以外其他多種微量元素, 微量元素?fù)诫s的羥基磷灰石(DHA)與人體骨磷灰石結(jié)構(gòu)更接近, 且已被證明具有更優(yōu)越的生物活性和更少的植入物炎癥反應(yīng)[9], 前期進(jìn)行的微量元素?fù)诫s羥基磷灰石研究印證了上述觀點(diǎn)[10-14]。然而, 磷灰石的高度脆性使其在頻繁承載負(fù)荷后發(fā)生過(guò)早的磨損和斷裂, 影響性能發(fā)揮的持久性。引入力學(xué)性能優(yōu)良的增韌材料制備復(fù)合涂層, 是目前改進(jìn)這一缺陷的有效方法[15-17]。

目前已上市的氧化鋯植入體幾乎均未使用涂層[18], 且尚未見(jiàn)氧化鋯植入體上制備羥基磷灰石涂層相關(guān)研究。本研究將鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(DHA)與氧化鋯按不同比例復(fù)合, 通過(guò)等離子噴涂法在氧化鋯基體上制備氧化鋯增韌的鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(ZrO2-DHA)復(fù)合涂層, 并對(duì)涂層的力學(xué)性能和體外生物學(xué)性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑和材料

氧化鋯基材10 mm×2 mm和25.4 mm×2.5 mm、氧化鋯粉體分別購(gòu)自蘇州阿洛泰和江蘇立達(dá)公司, 分析級(jí)Ca(H2PO4)2·H2O、Ca(OH)2、SrO、SiO2、CaF2和生物級(jí)4-硝基苯磷酸二鈉(PNPP)、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海阿拉丁公司。小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù), α-MEM培養(yǎng)基、青–鏈雙抗購(gòu)自賽默飛世爾, 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青,-甘油磷酸鈉(-GP)、抗壞血酸(AA)購(gòu)自西格瑪奧德里奇, 茜素紅S染色液購(gòu)自北京索萊寶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 涂層的制備

以Ca(OH)2和Ca(H2PO4)2?H2O為原料, 以SrO、SiO2和CaF2為微量元素引入劑, 水熱法合成HA和DHA。三種元素的摻雜量按照既往研究[12]投料, 使其在DHA中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與天然骨磷灰石保持一 致[19-21]。采用噴霧造粒法制備熱噴涂粉, 其中, DHA和ZrO2分別按照質(zhì)量比為7 : 3、5 : 5、3 : 7復(fù)合造粒。氧化鋯基材經(jīng)噴砂增加表面粗糙度, 然后使用大氣等離子噴涂設(shè)備(Dualumsch. Wasser, Sulzer Metco, Switzerland)按照表1中噴涂參數(shù)制備HA/DHA涂層和質(zhì)量比分別為7 : 3、5 : 5、3 : 7的ZrO2-DHA涂層(分別記為7DHA、5DHA、3DHA)。將得到的涂層樣品在650 ℃晶化處理2 h, 備用。

1.2.2 表征和力學(xué)性能

X射線衍射儀(UltimaⅣ, Rigaku, Japan)和傅里葉變換紅外光譜儀(IRAffinity-1, Shimadzu, Japan)檢測(cè)樣品相組成。掃描電鏡(s-4800, Hitachi, Japan)和光學(xué)顯微鏡觀察涂層表面和截面形貌。力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)設(shè)7DHA、5DHA、3DHA涂層實(shí)驗(yàn)組和DHA涂層對(duì)照組。維氏硬度計(jì)(HMV-G21DT, Shimadzu, Japan)和萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(UTM 5592-F2-G2, Instron, USA)檢測(cè)涂層硬度和結(jié)合強(qiáng)度: 硬度檢測(cè)隨機(jī)選擇涂層表面10個(gè)點(diǎn)測(cè)硬度值, 萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)每組5個(gè)樣品的涂層結(jié)合強(qiáng)度, 結(jié)果用(ˉ±s)表示。

1.2.3 體外生物學(xué)性能檢測(cè)

(1) 實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞培養(yǎng)和涂層浸提液制備

體外生物學(xué)性能實(shí)驗(yàn)增加空白對(duì)照組、ZrO2基材組和陽(yáng)性對(duì)照組(HA涂層)。小鼠成骨前體細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng), 每2 d換液一次, 確保生長(zhǎng)狀態(tài)良好。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT16886.12-2017[22],制備涂層浸提液。

表1 噴涂參數(shù)

(2) 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和毒性評(píng)級(jí)

涂層樣品滅菌后置于24孔板, MC3T3-E1以4× 104Cells/well接種, 細(xì)胞貼壁后更換低血清培養(yǎng)基(含0.5%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)孵育24 h, 避光加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT母液, 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出孔內(nèi)液體, 加入500 μL DMSO充分溶解結(jié)晶, 吸取300 μL紫色液體至96孔板, 酶標(biāo)儀(Multiskan FC, Thermo Fisher)檢測(cè)490 nm的吸光度。通過(guò)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(Relative Growth Rate, RGR)來(lái)評(píng)價(jià)涂層細(xì)胞毒性, 即RGR=(涂層組吸光度值/基材對(duì)照組吸光度值)×100%。若RGR≥100%, 則細(xì)胞毒性為0級(jí)。

(3) 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

相同方法接種多孔板, 在接種1、6和12 h后吸去培養(yǎng)液, 加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min, PBS沖洗2次, 避光加入300 μL DAPI熒光染液, 倒置熒光顯微鏡(TH4-200, Olympus, Japan)下觀察, 每個(gè)樣品隨機(jī)選取5個(gè)不同視野拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞, 細(xì)胞數(shù)用(ˉ±s)表示。

(4) 堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)

相同方法接種多孔板, 細(xì)胞貼壁后更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基, 每2 d換液一次, 于第1、7 d終止培養(yǎng), 加入0.2%曲拉通200 μL裂解細(xì)胞, 收集細(xì)胞裂解液離心, 吸取上清液50 μL至96孔板, 加入100 μL濃度為1 mg/mL的PNPP工作液, 細(xì)胞培養(yǎng)條件繼續(xù)孵育30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm吸光度ODALP。BCA蛋白試劑盒檢測(cè)各孔總蛋白量(mg), ODALP/總蛋白值用(ˉ±s)表示。

(5) 成骨分化相關(guān)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)

相同方法接種多孔板, 細(xì)胞貼壁后更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液, 每2 d換液一次, 于第1、7 d終止培養(yǎng), 加入1 mL Trizol抽提細(xì)胞總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 熒光定量PCR儀(Step one plus, ABI, USA)擴(kuò)增成骨分化相關(guān)基因、和內(nèi)參基因(引物序列見(jiàn)表2), 得到Ct值, 使用ΔCt法計(jì)算各組各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

(6) 成骨礦化染色實(shí)驗(yàn)

相同方法接種多孔板, 細(xì)胞貼壁后更換涂層浸提液, 每2 d換液一次, 于第14 d終止培養(yǎng),每孔加入4%多聚甲醛500 μL固定15 min, PBS清洗2次后加入茜素紅S染色液200 μL避光染色15 min, PBS清洗至清洗液無(wú)色, 于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)及圖像用Jade6.5、OMNIC32、Microsoft Excel和Origin2018軟件處理、作圖。2組之間比較用t檢驗(yàn),<0.05為具有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 粉體和涂層結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)可見(jiàn)經(jīng)噴砂處理后, 氧化鋯基材呈現(xiàn)出不規(guī)則粗糙表面, 該表面有利于噴涂粉體與基材之間形成穩(wěn)固的結(jié)合。圖1(b)可見(jiàn)高溫熔融的液滴狀顆粒堆積而成的涂層表面, DHA粉體熔融狀態(tài)良好, 呈現(xiàn)等離子噴涂涂層表面形貌特征。圖中可見(jiàn)涂層微裂紋, 有助于釋放涂層內(nèi)應(yīng)力, 防止涂層剝落, 提高結(jié)合強(qiáng)度。涂層的粗糙表面有利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)。

圖2(a~c)分別為7DHA涂層表面拋光后的SEM照片及Ca (綠色)、Zr (藍(lán)色)元素分布的SEM照片, 深灰色區(qū)域(A)為含Ca的DHA, 灰白色區(qū)域(B)為ZrO2。圖2(d~f)和圖2(g~i)分別是DHA、7DHA、3DHA涂層的平面和截面照片, 可見(jiàn)DHA和ZrO2在涂層的三維結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)相互交錯(cuò)和包繞狀態(tài)。

圖3(a)是HA和DHA粉體的XRD圖譜, 符合羥基磷灰石標(biāo)準(zhǔn)譜(JCPDS No.09-0432), 表明本實(shí)驗(yàn)合成了羥基磷灰石材料; 插圖為2=30°~35°的局部放大, 可見(jiàn)DHA峰位出現(xiàn)了右移, 說(shuō)明元素的引入使DHA發(fā)生了晶格畸變。圖3(b)為兩者的FT-IR圖譜, 圖中可見(jiàn)羥基磷灰石的PO43–v4 (569、604 cm–1)、PO43–v3 (962、1042、1092 cm–1)和OH–(631 cm–1)的振動(dòng)峰, 以及719 cm–1處的OH?F鍵振動(dòng)峰。圖3(c)是三種組分ZrO2-DHA涂層的XRD圖譜, 三者具有相似的衍射峰相, 氧化鋯特征峰隨其含量增加而增強(qiáng)。圖3(d)是放大的7DHA涂層的XRD圖譜, 可見(jiàn)明顯的羥基磷灰石和氧化鋯衍射峰, 未見(jiàn)其他雜質(zhì)峰相。

圖1 氧化鋯基材(a)和DHA涂層表面(b)的SEM照片

圖2 7DHA涂層的SEM照片(a)和元素分布掃描照片(Ca(b)和Zr(c)); 涂層平面(d~f)和截面(g~i)的SEM照片: DHA(d, g)、7DHA (e, h)、3DHA (f, i)

圖3 HA和DHA粉體的XRD圖譜(a)及FT-IR譜圖 (b), DHA涂層的XRD圖譜(c)及7DHA涂層的放大XRD圖譜(d)

2.2 涂層力學(xué)性能

圖4(a)可見(jiàn), 涂層硬度和結(jié)合強(qiáng)度隨氧化鋯含量的增加而增大, 其中, DHA涂層的硬度和結(jié)合強(qiáng)度分別達(dá)到(250.8±18.9) HV和(25.1±2.6) MPa, 3DHA涂層的硬度和結(jié)合強(qiáng)度達(dá)到(526.2±23.6) HV和(46.2± 4.3) MPa。不同涂層組的硬度值和結(jié)合強(qiáng)度值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4(b)為5DHA涂層的拉伸斷面照片, 圖中可見(jiàn), 涂層拉伸斷面出現(xiàn)在基材–涂層界面、涂層內(nèi)部及涂層–膠水界面, 表明ZrO2-DHA涂層的拉伸斷裂屬于混合型失效模式。

2.3 涂層體外生物學(xué)性能

2.3.1 涂層對(duì)細(xì)胞活力的影響

圖5表示經(jīng)過(guò)24 h低血清培養(yǎng)后各組樣品對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響。DHA組、7DHA組、HA組和氧化鋯基材組的OD值分別為(0.46±0.02)、(0.44±0.02)、(0.39±0.01)和(0.37±0.01), 各組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 表明DHA涂層和7DHA涂層組與HA涂層和氧化鋯基材組相比, 具有較高的細(xì)胞活力。相對(duì)于氧化鋯基材, 各種DHA含量涂層的RGR均大于100%, DHA涂層的最大值達(dá)到125.3%, 提示各涂層的細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)均為0級(jí)。

圖4 涂層顯微硬度、結(jié)合強(qiáng)度(a)以及拉伸斷面照片(b)

圖5 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)OD值

2.3.2 涂層對(duì)細(xì)胞黏附的影響

圖6(a~f)是各組樣品在細(xì)胞接種后第6 h的細(xì)胞黏附照片, 藍(lán)色斑點(diǎn)為熒光染液著色的細(xì)胞核。圖6(g)是各組樣品在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞黏附數(shù)量柱狀圖。在第6 h, HA組、DHA組和7DHA組的細(xì)胞粘附數(shù)量分別為29.40、41.60和39.20, 后兩組明顯高于前者, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 但5DHA組和3DHA組的細(xì)胞黏附數(shù)量分別為30.20、29.00, 與HA組相比未見(jiàn)明顯差異。在第1和12 h可見(jiàn)相同的趨勢(shì)。DHA涂層和7DHA涂層與HA涂層相比促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附, 而隨著ZrO2含量的增加, 促進(jìn)作用逐漸減弱。

2.3.3 涂層對(duì)細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的影響

圖7(a~f)是培養(yǎng)14 d的MC3T3-E1茜素紅S染色照片, 可見(jiàn)DHA組礦化最明顯, 其次為7DHA組, 兩組結(jié)果均優(yōu)于其他各組。圖7(g)是MC3T3-E1培養(yǎng)1、7 d后的堿性磷酸酶活性柱狀圖?？梢?jiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), ALP活性逐漸增強(qiáng); 在第7 d, DHA組和7DHA組的ALP活性分別達(dá)到(0.96±0.02)和(0.89± 0.01) OD/mg, 明顯高于HA組的(0.82±0.01) OD/mg, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。礦化染色實(shí)驗(yàn)和ALP活性實(shí)驗(yàn)提示, DHA涂層和7DHA涂層促進(jìn)成骨分化能力優(yōu)于HA涂層。

圖6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的熒光照片(a~f)和細(xì)胞黏附數(shù)量(g)

圖7 MC3T3-E1細(xì)胞茜素紅染色照片(a~f)和ALP活性比較(g)

2.3.4 涂層對(duì)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

成骨分化相關(guān)基因和的相對(duì)表達(dá)見(jiàn)圖8。圖8(a)可見(jiàn), 在細(xì)胞培養(yǎng)的第1 d, 各組表達(dá)幾乎未見(jiàn)差別。在細(xì)胞培養(yǎng)的第7 d, DHA組和7DHA組的相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到3.35和2.84, 明顯高于HA組的2.51, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖8(b)中,的表達(dá)情況與出現(xiàn)相同的趨勢(shì), 提示與HA涂層相比, DHA涂層和7DHA組可促進(jìn)成骨細(xì)胞早期表達(dá)成骨功能基因。

圖8 成骨相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間變化圖

(a)expression; (b)expression (*<0.05)

3 討論

體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明, DHA涂層的促成骨性能優(yōu)于HA涂層和ZrO2基材, 三種微量元素的引入是涂層促成骨性能提升的主要因素。鍶是鈣的同族元素, 取代HA中鈣(1)后可使晶格尺寸增加、晶格穩(wěn)定性下降[23], 從而提高溶解度[24]; 硅元素取代PO43–, 使HA產(chǎn)生晶格缺陷和更多的負(fù)電表面[25]; 氟元素引入HA后造成Ca(2)空位, 引起晶格缺陷[14]。本研究合成的DHA的XRD圖譜中, 特征峰位發(fā)生了右移, 提示元素成功引入羥基磷灰石晶格中, 并導(dǎo)致了晶格結(jié)構(gòu)改變。因微量元素引入造成的晶格缺陷提高了DHA在體液環(huán)境中的溶解度, 釋出的Sr2+擁有刺激成骨細(xì)胞分泌新生骨組織基質(zhì), 抑制破骨細(xì)胞活性、減少骨吸收的雙重調(diào)節(jié)功能[26-29], Si元素和F–則促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[14,30-32]。體外生物學(xué)性能的研究結(jié)果表明, 本研究所制備的DHA涂層在促成骨性能提高方面具有多元素協(xié)同作用[12], 相比于HA涂層表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù), 從機(jī)制角度佐證了上述促成骨性能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。和是成骨分化標(biāo)志性功能蛋白, 兩者在早期成骨細(xì)胞分化、骨組織基質(zhì)形成等方面發(fā)揮了重要作用。在細(xì)胞培養(yǎng)第7 d, DHA涂層的和表達(dá)量是ZrO2基材的3~4倍, 明顯高于HA涂層。鍶元素可引起以Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子()以及/信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子-連環(huán)蛋白()和卷曲8 ()的上調(diào)[33-34], 而該信號(hào)通路在骨骼發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。Honda等[31]證明微量硅摻雜HA可上調(diào)成骨分化相關(guān)基因、、、和表達(dá), Sun等[10]進(jìn)一步檢測(cè)了微量硅摻雜HA對(duì)多達(dá)20余種成骨分化信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)、、、和的高表達(dá)。Li等[30]則證明微量氟摻雜HA可上調(diào)、、和的表達(dá), Wang的研究[14]進(jìn)一步表明微量氟摻雜HA可增加和的表達(dá)。ZrO2-DHA涂層含有鍶、硅、氟三種微量元素, 三種元素通過(guò)不同的分子生物學(xué)機(jī)制提高了ZrO2-DHA涂層的成骨活性。

ZrO2-DHA涂層的促成骨性能與涂層中DHA的含量呈正相關(guān), DHA的含量越多, 涂層生物學(xué)性能越好。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, DHA涂層和ZrO2-DHA涂層對(duì)MC3T3-E1毒性評(píng)級(jí)為0; 而與ZrO2基材相比, DHA涂層和ZrO2-DHA涂層在不同程度上增強(qiáng)了細(xì)胞活力。促成骨分化實(shí)驗(yàn)證實(shí), DHA涂層和ZrO2-DHA涂層的早期促成骨性能明顯優(yōu)于ZrO2基材。這些結(jié)果顯示ZrO2-DHA作為涂層材料在植入體促成骨性能方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

ZrO2-DHA涂層力學(xué)性能與ZrO2含量呈正相關(guān), ZrO2含量越多, 涂層力學(xué)性能越好。力學(xué)性能的提升來(lái)自ZrO2的增韌作用, 最先沉積在氧化鋯基材表面的ZrO2熔融液滴, 與氧化鋯基材的結(jié)合力較DHA更強(qiáng)。DHA和ZrO2粉體在密度、粒徑等方面存在差異, 熔融狀態(tài)不完全一致, 在氧化鋯基材上沉積時(shí)相互交織、包繞和穿插, 形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使ZrO2-DHA涂層對(duì)殘余熱應(yīng)力、壓應(yīng)力和拉伸力的承受能力較DHA涂層明顯提升, 對(duì)植入體涂層在硬組織內(nèi)發(fā)揮長(zhǎng)期作用具有重要意義。

ZrO2-DHA涂層的生物活性雖有所減弱, 但7DHA涂層的早期促成骨活性仍優(yōu)于HA涂層。結(jié)合生物學(xué)性能方面的優(yōu)勢(shì), 7DHA涂層在早期促成骨性和對(duì)植入體受到硬組織機(jī)械力的抗性均優(yōu)于HA涂層, 是一種理想的生物活性涂層材料。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)等離子噴涂法在氧化鋯基材上制備了鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石涂層和氧化鋯增韌鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石涂層, 為氧化鋯植入體的表面改性提供了新的依據(jù)。通過(guò)涂層的力學(xué)性能和體外生物學(xué)性能的研究得到以下結(jié)論:

1) DHA涂層在體外的早期促成骨性能優(yōu)于HA涂層和ZrO2基材。

2) ZrO2-DHA涂層的促成骨性能明顯優(yōu)于ZrO2基材, 這是由涂層中的DHA組分決定的。ZrO2-DHA復(fù)合涂層的促成骨性能與DHA含量呈正相關(guān)。

3) ZrO2-DHA涂層的力學(xué)性能明顯優(yōu)于DHA涂層, 涂層中ZrO2與DHA復(fù)合形成三維結(jié)構(gòu)。ZrO2-DHA涂層的力學(xué)性能與ZrO2含量呈正相關(guān)。

4) 相對(duì)于HA涂層, 7DHA涂層在體外促成骨性能和力學(xué)性能方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。在氧化鋯植入體表面制備DHA和ZrO2比例為7 : 3的涂層, 是一種具有應(yīng)用前景的硬組織植入材料。

[1] PAYER M, HESCHL A, KOLLER M,. All-ceramic restoration of zirconia two-piece implants--a randomized controlled clinical trial., 2015, 26(4): 371–376.

[2] BANKOGLU G M, AYDIN C, YILMAZ H,. An overview of zirconia dental implants basic properties and clinical application of three cases., 2014, 40(4): 485–494.

[3] BAN S. Reliability and properties of core materials for all-ceramic dental restorations., 2008, 44(1): 3–21.

[4] GAHLERT M, ROEHLING S, SPRECHER C M,.performance of zirconia and titanium implants: a histomorphometric study in mini pig maxillae., 2012, 23(3): 281–286.

[5] KOHAL R J, WOLKEWITZ M, HINZE M,. Biomechanical and histological behavior of zirconia implants: an experiment in the rat., 2009, 20(4): 333–339.

[6] BIANCO P D, DUCHEYNE P, CUCKLE J M. Local accumulation of titanium released from a titanium implant in the absence of wear., 1996, 31: 227–234.

[7] TSCHEMITSCHEK H, BORCHERS L, GEURTSEN W. Nonalloyed titanium as a bioinert metal—a review., 2006, 96(1): 523–530.

[8] FRANSSON C, LEKHOLM U, JEMT T,. Prevalence of subjects with progressive bone loss at implants., 2005, 16(4): 440–446.

[9] ZHOU H, LEE J. Nanoscale hydroxyapatite particles for bone tissue engineering., 2011, 7(7): 2769–2781.

[10] SUN T, WANG M, SHAO Y,. The effect and osteoblast signaling response of trace silicon doping hydroxyapatite., 2018, 181(1): 82–94.

[11] XIAO S, WANG M, WANG L,. Environment-friendly synthesis of trace element Zn, Sr, and F codoping hydroxyapatite with non- cytotoxicity and improved osteoblast proliferation and differentiation., 2018, 185(1): 148–161.

[12] GAO J, WANG M, SHI C,. A facile green synthesis of trace Si, Sr and F multi-doped hydroxyapatite with enhanced biocompatibility and osteoconduction., 2017, 196: 406–409.

[13] GAO J, WANG M, SHI C,. Synthesis of trace element Si and Sr codoping hydroxyapatite with non-cytotoxicity and enhanced cell proliferation and differentiation., 2016, 174(1): 208–217.

[14] WANG L, WANG M, LI M,. Trace fluorine substituted calcium deficient hydroxyapatite with excellent osteoblastic activity and antibacterial ability., 2018, 20(38): 5744–5753.

[15] YUGESWARAN S, YOGANAND C P, KOBAYASHI A,. Mechanical properties, electrochemical corrosion andbioactivity of yttria stabilized zirconia reinforced hydroxyapatite coatings prepared by gas tunnel type plasma spraying., 2012, 9: 22–33.

[16] KHOR K A, GU Y W, PAN D,. Microstructure and mechanical properties of plasma sprayed HA/YSZ/Ti-6Al-4V composite coatings., 2004, 25(18): 4009–4017.

[17] 吳永智. 等離子噴涂羥基磷灰石納米氧化鋯梯度涂層的研究. 北京: 北京工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2008.

[18] XIE L, WU X, LI W,. Latest research on zirconia implant surface treatment., 2017, 21(10): 1623–1628.

[19] SZURKOWSKA K, KOLMAS J. Hydroxyapatites enriched in silicon–bioceramic materials for biomedical and pharmaceutical applications., 2017, 27(4): 401–409.

[20] ZIPKIN I, MCCLURE F J, LEE W A. Relation of the fluoride content of human bone to its chemical composition., 1960, 2: 190–195.

[21] TRUEMAN CN, TUROSS N. Trace elements in recent and fossil bone apatite., 2002, 48(1): 489–521.

[22] GBT16886.12-2017/ISO10993-12:2012, Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials.

[23] FRASNELLI M, CRISTOFARO F, SGLAVO V M,. Synthesis and characterization of strontium-substituted hydroxyapatite nano-particles for bone regeneration., 2017, 71: 653–662.

[24] NI GX, SHU B, HUANG G,. The effect of strontium incorporation into hydroxyapatites on their physical and biological properties., 2012, 100(2): 562–568.

[25] TANG Q, BROOKS R, RUSHTON N,. Production and characterization of HA and SiHA coatings., 2010, 21(1): 173–181.

[26] CANALIS E, HOTT M, DELOFFRE P,. The divalent strontium salt S12911 enhances bone cell replication and bone formation., 1996, 18(6): 517–523.

[27] BONNELYE E, CHABADEL A, SALTEL F,. Dual effect of strontium ranelate: stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation and resorption., 2008, 42(1): 129–138.

[28] TAKAHASHI N, SASAKI T, TSOUDEROS Y,. S 12911-2 inhibits osteoclastic bone resorption., 2003, 18(6): 1082–1087.

[29] BUEHLER J, CHAPPUIS P, SAFFAR J L,. Strontium ranelate inhibits bone resorption while maintaining bone formation in alveolar bone in monkeys ()., 2001, 29(2): 176–179.

[30] LI Z, HUANG B, MAI S,. Effects of fluoridation of porcine hydroxyapatite on osteoblastic activity of human MG63 cells., 2015, 16(3): 035006.

[31] HONDA M, KIKUSHIMA K, KAWANOBE Y,. Enhanced early osteogenic differentiation by silicon-substituted hydroxyapatite ceramics fabricatedultrasonic spray pyrolysis route., 2012, 23(12): 2923–2932.

[32] HONDA M, KIKUSHIMA K, KAWANOBE Y,. Cell proliferation, morphology and differentiation of transgenic-cloned pig calvarial osteoblasts on the silicon-substituted hydorxyapatite ceramics fabricatedultrasonic spray-pyrolysis technique., 2011, 47(1): 37–41.

[33] ZHOU J, LI B, LU S,. Regulation of osteoblast proliferation and differentiation by interrod spacing of Sr-HA nanorods on microporous titania coatings., 2013, 5(11): 5358–5365.

[34] YANG F, YANG D, TU J,. Strontium enhances osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells andbone formation by activating Wnt/catenin signaling., 2011, 29(6): 981–991.

Zirconia Reinforced Trace Element Co-doped Hydroxyapatite Coating

DAI Zhao1, WANG Ming2, WANG Shuang1, LI Jing1, CHEN Xiang1, WANG Da-Lin1, ZHU Ying-Chun2

(1. Hospital of Changhai, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2. Key Laboratory of Inorganic Coating Materials, Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China)

Zirconia is a kind of prospective hard tissue implant materials, which possesses superior mechanical properties and excellent biocompatibilities. To promote the stable osseointegration between Zirconia implants and tissue, zirconia-toughened trace Sr-, Si- and F- co-doped hydroxyapatite (ZrO2-DHA) was coated by plasma spraying on zirconia. The phase composition and structure of coatings were characterized, and the mechanical properties andbiological properties were investigated. The results show that co-doping of trace Sr, Si and F enhances the biological properties of coatings on adhesion and differentiation of osteoblasts through the signal transduction pathway of osteogenic differentiation. All of ZrO2-DHA coatings promote the cell viability and gene expression in osteogenic differentiation of MC3T3-E1. On the 7th day of cell culture, the relative expression levels ofandin the ZrO2-DHA coating containing 70% DHA (7DHA) were about 2.8 times and 2.3 times higher than those in the ZrO2substrate group, respectively. Mechanical properties of ZrO2-DHA coatings are improved with the increment of zirconia ratio. Hardness of DHA coating and 7DHA coating are 250.8 and 313 HV respectively and their bond strength are 25.1 and 31.8 MPa, respectively. 7DHA coatings with network structure possess both excellent mechanical and biological performance for the implant coating application.

Sr/Si/F trace-doped hydroxyapatite; plasma spraying; zirconia reinforcing; mechanical property; osteogenesis

TQ174

A

1000-324X(2020)02-0179-08

10.15541/jim20190053

2019-01-27;

2019-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(51232007) National Natural Science Foundation of China (51232007)

代釗(1989–), 男, 碩士研究生. E-mail: zhaodai313@126.com

DAI Zhao (1989–), male, Master candidate. E-mail: zhaodai313@126.com

汪大林, 教授. E-mail: wang_dento@163.com; 祝迎春, 研究員. E-mail: yzhu@mail.sic.ac.cn

WAN Da-Lin, professor. E-mail: wang_dento@163.com; ZHU Ying-Chun, professor. E-mail: yzhu@mail.sic.ac.cn